·基础论著·
羧胺三唑对ＴＮＦ唱α诱导的佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞中细胞因子分泌和ＮＦ唱κＢ活化的影响传送侦测怎么做
朱蕾 李娟 武丹威 罗丽丰 郭磊 于晓丽 叶菜英 张德昌
ＤＯＩ：１０畅３８７７／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４唱０７８５．２０１３．１１．０３６
基金项目：国家自然科学基金（８１１０２４５４）；“重大新药创制”科技重大专项（２００９ＺＸ０９１０２唱０４９）；中国医学科学院院所长基金（２０１０ＰＹ０１，２０１０ＰＹ０８）
作者单位：１００００５ 北京，中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院药理系
通讯作者：叶菜英，Ｅｍａｉｌ：ｃａｉｙｉｎｇｙｅ＠１２６．ｃｏｍ
【摘要】 目的 探讨羧胺三唑对ＴＮＦ唱
α诱导的佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞分泌促炎细胞因子的影响及部分机制。方法 用弗氏完全佐剂诱导大鼠佐剂性关节炎模型，分离培养的佐剂性关节炎成纤维样滑膜细胞用２０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ唱α
刺激并用不同浓度羧胺三唑（１０、２０、４０μｍｏｌ／Ｌ）处理。ＥＬＩＳＡ法检测成纤维样滑膜细胞上清中ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６含量，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＮＦ唱κＢｐ６５的蛋白表达。结果 经２０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ唱α刺激后，成纤维样滑膜细胞分泌ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６水平，以及细胞核中ＮＦ唱κＢｐ６５的表达显著增加（Ｐ＜
０畅０１）。羧胺三唑（２０、４０μｍｏｌ／Ｌ）能够显著抑制ＴＮＦ唱α诱导的ＩＬ唱１β［（４１７畅３９±２９畅８０）ｐｇ／ｍｌｖｓ．（２６４畅６３±９畅３５）ｐｇ／ｍｌ，（１８６畅１３±２５畅７１）ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０畅０１］和ＩＬ唱６［（３８３畅４５±３２畅１３）ｐｇ／ｍｌｖｓ．（２４８畅３９±３０畅５１）ｐｇ／ｍｌ，（１８９畅６４±２７畅８６）ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０畅０１］分泌，且明显减少细胞核中ＮＦ唱κＢｐ６５的表达（Ｐ＜０畅０１）。结论 羧胺三唑可能通过抑制ＮＦ唱κＢ活化来减少ＴＮＦ唱α诱导的佐剂性关节炎成纤维样滑膜细胞中促炎细胞因子ＩＬ唱１β、ＩＬ唱６的产生。
【关键词】 ＮＦ唱κＢ； 肿瘤坏死因子α； 细胞因子类； 羧胺三唑； 成纤维样滑膜细胞
ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅｏｎＴＮＦ唱α唱ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅｓｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｎｄＮＦ唱κＢａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ唱ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍａｄｊｕｖａｎｔａｒｔｈｒｉｔｉｓｒａｔ
ｓ ＺＨＵＬｅｉ，ＬＩＪｕａｎ，ＷＵＤａｎ唱ｗｅｉ，ＬＵＯＬｉ唱ｆｅｎｇ，ＧＵＯＬｅｉ，ＹＵＸｉａｏ唱ｌｉ，ＹＥＣａｉ唱ｙｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＤｅ唱ｃｈａｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ＆ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００００５，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＹＥＣａｉ唱ｙｉｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｃａｉｙｉｎｇｙｅ＠１２６．ｃｏｍ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＣＡＩ）ｏｎＴＮＦ唱α唱ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅｓｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ唱ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ（ＦＬＳ）ｆｒｏｍａｄｊｕｖａｎｔａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＡＡ）ｒａｔｓａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｒｅｕｎｄ′ｓｃｏｍｐｌｅｔｅｄａｄｊｕｖａｎｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｎｄｕｃｅＡＡｉｎｒａｔｓ．ＦＬＳｆｒｏｍＡＡｒａｔｓｗｅｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｗｉｔｈ２０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ唱αａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈＣＡＩａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ１０，２０，４０μｍｏｌ／Ｌ．ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＩＬ唱１βａｎｄＩＬ唱６ｉｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍ
ｉｎｅｄｂｙＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＦ唱κＢｐ６５ｉｎｔｈｅｃｅｌｌｎｕｃｌｅｕｓｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴＮＦ唱αｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＩＬ唱１βａｎｄＩＬ唱６，ａｎｄｔｈｅ
ｎｕｃｌｅａｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＦ唱κＢｐ６５ｉｎｔｈｅＦＬＳ（Ｐ＜０畅０１）．ＣＡＩ（２０，４０μｍｏｌ／Ｌ）ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｏｆＩＬ唱１β［（４１７畅３９±２９畅８０）ｐｇ／ｍｌｖｓ．（２６４畅６３±９畅３５）ｐｇ／ｍｌ，（１８６畅１３±２５畅７１）ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０畅０１］ａｎｄＩＬ唱６［（３８３畅４５±３２畅１３）ｐｇ／ｍｌｖｓ．（２４８畅３９±３０畅５１）ｐｇ／ｍｌ，（１８９畅６４±２７畅８６）ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０畅０１］ｉｎＴＮＦ唱α唱ｉｎｄｕｃｅｄＦＬＳ，ａｎｄＣＡＩ（２０，４０μｍｏｌ／Ｌ）ａｌｓｏｉｎｈｉｂｉｔｅｄＮＦ唱κＢｐ６５ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓｏｆＴＮＦ唱α唱ｉｎｄｕｃｅｄＦＬＳ（Ｐ＜０畅０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＣＡＩａｔｔｅｎｕａｔｅｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｐｒｏ唱ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓｓｕｃｈａｓＩＬ唱１βａｎｄＩＬ唱６ｔｈｒｏｕｇｈｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦ唱κＢ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 ＮＦ唱ｋａｐｐａＢ； Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ唱ａｌ
ｐｈａ； Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ； Ｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ；
Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ唱ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ
类风湿关节炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ）是常见的慢 性、系统性自身免疫性疾病，以滑膜炎症和关节进行性破坏为主要特征。成纤维样滑膜细胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ唱ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ）是滑膜组织的主要组成部分，其功能活化是导致类风湿关节炎关节破坏的重要原因。研究发现，成纤维样滑膜细胞活化与滑膜组织中高水平的促炎细胞因子密切相关，尤其ＴＮＦ唱α，能够诱导成纤维样
滑膜细胞产生多种细胞因子（如ＩＬ唱１β、ＩＬ唱６）和基质金属蛋白酶（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ＭＭＰｓ）等，破坏软骨和骨组织，导致类风湿关节炎关节病变持续存在、迁延进展［１唱３］。
羧胺三唑（ｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ）是一种非细胞毒新型抗肿瘤药物，在体外和体内均有一定的抗肿瘤增殖和转移的作用［４唱５］。我们前期研究发现羧胺三唑具有抗炎作用。在类风湿关节炎的动物模型———大鼠佐剂性关节炎（ａｄｊｕｖａｎｔａｒｔｈｒｉｔｉｓ）模型上，羧胺三唑预防给药能够减轻佐剂性关节炎大鼠的足爪肿胀，并降低血清和足爪均浆中促炎细胞因
ＴＮＦ唱α和ＩＬ唱１β水平［６］。为进一步探讨羧胺三唑用于类风湿关节炎的开发前景，本实验在建立大鼠佐剂性关节炎模型并分离、培养和鉴定成纤维样滑膜细胞的基础上，观察羧胺三唑对ＴＮＦ唱α诱导的佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞分泌促炎细胞因子ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６的影响，以及对启动上述分子转录的核因子唱κＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ唱κＢ，ＮＦ唱κＢ）活化的影响。
材料与方法
一、实验材料
１．药品和试剂：羧胺三唑由中国医学科学院药物研究所合成，纯度（ＨＰＬＣ）达９９％以上，用二甲基亚砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）配制成４０ｍｍｏｌ／Ｌ的贮存液，－２０℃避光保存，临用前用ＤＭＥＭ高糖培养基稀释至所需浓度。ＴＮＦ唱α购自美国Ｒ＆Ｄ公司，用灭菌磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＰＢＳ）配制成１０μｇ／ｍｌ的贮存液，－２０℃保存，临用前用ＤＭＥＭ高糖培养基稀释。ＤＭＥＭ高糖培养基购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，胎牛血清购自美国Ｇｉｂｃｏ公司，ＤＭＳＯ和胶原酶ⅠＡ购自美国Ｓｉｇｍａ公司，胞核唱胞质蛋白制备试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，ＮＦ唱κＢｐ６５小鼠单克隆抗体购自美国Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司，ＴＡＴＡｂｉｎｄｉｎ钛阳极氧化
ｇｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＰ）小鼠单克隆抗体购自美国Ａｂｃａｍ公司，波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）小鼠单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６
ＥＬＩＳＡ试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司，其他分析纯均为国产。
２．动物：Ｌｅｗｉｓ大鼠，雄性，清洁级，体重（１９５±１５）ｇ，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：ＳＣＸＫ（京）２００６唱０００９。动物保护、使用和所有程序都按照动物伦理委员会的要求操作。
二、实验方法
１．大鼠佐剂性关节炎模型的制备［７］：将卡介苗置８０℃水浴灭活１ｈ，以高压灭菌的液体石蜡配成１０ｍｇ／ｍｌ的乳剂，充分研磨、混匀，即得弗氏完全佐剂（Ｆｒｅｕｎｄ′ｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）。在每只大鼠尾根部２～３点时钟位皮内注射０畅１ｍｌ弗氏完全佐剂致炎，诱导佐剂性关节炎模型。
２．成纤维样滑膜细胞的分离和培养［８］：致炎后第２７天处死佐剂性关节炎大鼠，无菌取关节滑膜组织，用无Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋的Ｄ唱ｈａｎｋ液反复洗３次后，剪成１～２ｍｍ３小块，加入含胶原酶ⅠＡ（１ｍｇ／ｍｌ）的ＤＭＥＭ培养液（２～３倍体积），３７℃、５％ＣＯ２消化２ｈ后，
２００目不锈钢筛网过滤，将滤液离心（１０００×ｇ，１０ｍｉｎ），弃上清。用ＰＢＳ洗２次后，将细胞重悬于含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中，３７℃、５％ＣＯ２培养２４ｈ后换液，弃去未贴壁细胞，继续培养。以后每２～３ｄ换液１次，待细胞长满后用０畅０５％胰酶消化，传代培养。取第３代细胞用于实验。
３．免疫组化鉴定成纤维样滑膜细胞：将无菌的小盖玻片置于２４孔板中，将细胞悬液接种于盖玻片上，待细胞均匀铺满玻片时，取出玻片，用ＰＢＳ洗涤３次，用甲醇固定１０ｍｉｎ，洗涤干燥后，用正常羊血清封闭３０ｍｉｎ，加入Ｖｉｍｅｎｔｉｎ小鼠单克隆抗体（１∶１００），４℃孵育过夜。第二天将切片在室温平衡１ｈ后，ＰＢＳ洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ＩｇＧ二抗（１∶５００），室温孵育１ｈ，ＤＡＢ显，蒸馏水冲洗，苏木素复染，乙醇梯度脱水，中性树胶封片。显微镜下观察并拍照。
４．ＥＬＩＳＡ法检测成纤维样滑膜细胞上清液中ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６水平：将第３代成纤维样滑膜细胞用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液制备细胞悬液（１×１０８／Ｌ），加至２４孔板，每孔１ｍｌ。实验分为６组：对照组（只加培养液），ＴＮＦ唱α组（加入终浓度为２０ｎｇ／ｍｌ的ＴＮＦ唱α［９］），ＤＭＳＯ组（溶剂对照组，加入终浓度为０畅１％的
ＤＭＳＯ和２０ｎｇ／ｍｌ的ＴＮＦ唱α），１０、２０、４０μｍｏｌ／Ｌ羧胺三唑组（加入不同浓
度羧胺三唑和２０ｎｇ／ｍｌ的ＴＮＦ唱α），每组设４个复孔，置３７℃、５％ＣＯ２培养箱培养２４ｈ。吸弃原培养液，对照组和ＴＮＦ唱α组加入新鲜培养液，ＤＭＳＯ组加入含０畅１％ＤＭＳＯ的培养液，羧胺三唑各组加入含相应浓度羧胺三唑的培养液，继续培养１ｈ。除对照组外，其余各组再加入ＴＮＦ唱α（终浓度２０ｎｇ／ｍｌ），培养２４ｈ后收集上清，－２０℃保存，采用ＥＬＩＳＡ法检测上清中ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６含量，操作按照试剂盒说明书进行。
５．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测成纤维样滑膜细胞细胞核中ＮＦ唱κＢｐ６５的蛋白表达：将第３代成纤维样滑膜细胞以１×１０５个／孔接种于６孔板中，实验分组同上述方法３，每组设３个复孔，置３７℃、５％ＣＯ２培养箱培养２４ｈ后，吸弃原培养液。对照组和ＴＮＦ唱α组加入新鲜
培养液，ＤＭＳＯ组加入含０畅１％ＤＭＳＯ的培养液，羧胺三唑各组加入含相应浓度羧胺三唑的培养液，继续培养１ｈ。除对照组外，其余各组再加入ＴＮＦ唱α（终浓度２０ｎｇ／ｍｌ），培养３０ｍｉｎ后用胞核唱胞质蛋白制备试剂盒提取细胞核蛋白，具体步骤按照试剂盒说明书操作。蛋白定量采用ＢＣＡ法。取蛋白样品４０μｇ，加上样缓冲液煮沸变性后，在１２％的ＳＤＳ唱聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，分离胶和浓缩胶的电压分别为８０Ｖ和１２０Ｖ；电转至ＰＶＤＦ膜；用含５％脱脂奶粉的ＴＢＳＴ封闭２ｈ；洗膜５次，每次５ｍｉｎ；分别加入适量的ＮＦ唱κＢｐ６５小鼠单克隆抗体（１∶５００）或ＴＢＰ小鼠单克隆抗体（１：５００），４℃过夜；洗膜５次，每次５ｍｉｎ；加入辣根过氧化物酶标记的二抗（１∶４０００），３７℃孵育１ｈ；洗膜５次，每次５ｍｉｎ；
ＥＣＬ化学发光并照相。利用Ｋｏｄａｋ１Ｄ图像分析软件对图像中的蛋白条带进行灰度分析，以ＮＦ唱κＢｐ６５灰度值与内参ＴＢＰ灰度值之比反映ＮＦ唱κＢｐ６５的蛋白表达水平。
抗振压力表三、统计学分析
pcb柔性连接器用ＳＰＳＳ１１畅５软件进行统计学分析。所有检测结果以均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示。组间比较采用单因素方差分析，用Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法做两两比较，Ｐ＜０畅０５表示差异有统计学意义。
结 果
１．成纤维样滑膜细胞的鉴定：分离培养的第３代细胞，在倒置显微镜下具有成纤维样形态，呈长梭形极向生长。Ｖｉｍｅｎｔｉｎ是中胚层组织的特征性蛋白，免疫组化染结果显示，细胞抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ染阳性，胞质内见大量棕黄颗粒，衬染的核呈蓝，纯度在９９％以上，符合成纤维样滑膜细胞的特征。见图１。
２．羧胺三唑对ＴＮＦ唱α诱导的成纤维样滑膜细胞分泌ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６的影响：对照组成纤维样滑膜细胞上清液中ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６水平较低，经２０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ唱α刺激后，成纤维样滑膜细胞分泌ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６水平显著增加，与对照组比较有统计学差异（Ｐ＜０畅０１）。溶剂
ＤＭＳＯ对ＴＮＦ唱α诱导的成纤维样滑膜细胞细胞分泌ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６水平无影响（Ｐ＞０畅０５），而羧胺三唑２０和４０μｍｏｌ／Ｌ对ＴＮＦ唱α诱导的ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６产生有明显抑制作用，与ＤＭＳＯ组比较均有统计学差异（Ｐ＜０畅０１）。见表１。
３．羧胺三唑对ＴＮＦ唱α诱导的成纤维样滑膜细胞细胞核中ＮＦ唱κＢｐ６５表达的影响：ＮＦ唱κＢｐ６５在对照组成纤维样滑膜细胞的细胞核中有少量基础表达，２０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ唱α能够明显诱导成纤维样滑膜细胞细胞核中ＮＦ唱κＢｐ６５的表达增加，与对照组比较有统计学差异（Ｐ＜０畅０１）。溶剂ＤＭＳＯ对ＮＦ唱κＢｐ６５表达水平无影响（Ｐ＞０畅０５），而羧胺三唑２０和４０μｍｏｌ／Ｌ对ＴＮＦ唱α诱导的成纤维样滑膜细胞细胞核中ＮＦ唱κＢｐ６５增加有显著抑制作用，与ＤＭＳＯ组比较均有统计学差异（Ｐ＜０畅０１）。见图２。
表１ 羧胺三唑对ＴＮＦ唱α诱导的成纤维样滑膜细胞分泌
组别孔数ＩＬ唱１βＩＬ唱６
对照组４１２９畅３７±１１畅５８８３畅１３±１９畅１８ＴＮＦ唱α组４４０７畅１３±４０畅１０ａ３７６畅３２±３０畅５０ａＴＮＦ唱α＋ＤＭＳＯ组４４１７畅３９±２９畅８０ａ３８３畅４５±３２畅１３ａＴＮＦ唱α＋羧胺三唑１０μｍｏｌ／Ｌ组４３８７畅８０±２７畅６４３６０畅９４±２３畅９５ＴＮＦ唱α＋羧胺三唑２０μｍｏｌ／Ｌ组４２６４畅６３±９畅３５ｂ２４８畅３９±３
０畅５１ｂＴＮＦ唱α＋羧胺三唑４０μｍｏｌ／Ｌ组４１８６畅１３±２５畅７１ｂ１８９畅６４±２７畅８６ｂ 注：与对照组比较，ａＰ＜０畅０１；与ＴＮＦ唱α＋ＤＭＳＯ组比较，ｂＰ＜０畅０１
讨 论
类风湿关节炎的病因和发病机制目前仍不十分清楚，但促炎细胞因子在类风湿关节炎滑膜炎症和关节破坏中的重要作用已得到越来越多的关注。其中，ＴＮＦ唱α被认为是与类风湿关节炎滑膜炎症发生和发展最密切的促炎细胞因子［１］。研究发现，类风湿关节炎患者关节滑液中ＴＮＦ唱α水平明显升高，且与关节炎的严重程度呈正相关，抗ＴＮＦ唱α抗体能有效延缓滑膜炎症的进展并减轻类风湿关节炎患者关节炎的症状［１０唱１１］。成纤维样滑膜细胞是类风湿关节炎关节破坏的效应细胞，滑膜组织中高水平的ＴＮＦ唱α通过活化成纤维样滑膜细胞中ＮＦ唱κＢ等信号转导通路，诱导成纤维样滑膜细胞产生大量ＭＭＰｓ、前列腺素Ｅ２和多种细胞因子，包括ＴＮＦ唱α本身和ＩＬ唱１β、ＩＬ唱６等，它们相互作用，持续刺激成纤维样滑膜细胞形成恶性循环，维持滑膜炎症并导致关节破坏［１２唱１３］。ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６也是类风湿关节炎发病机制中的重要细胞因子，可诱导产生更多细胞因子、炎症介质和胶原酶，协助炎症细胞迁徙至关节腔，刺激滑膜组织增生等［１］。本实验建立大鼠佐剂性关节炎模型并分离培养成纤维样滑膜细胞，结果发现，在２０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ唱α刺激下，成纤维样滑膜细胞分泌ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６水平明显增加，而羧胺三唑能够显著降低ＴＮＦ唱α诱导的ＩＬ唱１β和ＩＬ唱６分泌。我们在前期研究中也发现，羧胺三唑预防给药能够降低佐剂
性关节炎大鼠血清和足爪均浆中升高的ＴＮＦ唱α和ＩＬ唱１β水平。提示，羧胺三唑的抗关节炎作用可能与其对促炎细胞因子的抑制作用有关。
ＮＦ唱κＢ是调控促炎细胞因子表达的重要转录因子，
主要以ｐ５０／ｐ６５异源二聚体形式存在。静息状态下，ｐ５０／ｐ６５与其抑制蛋白ΙκＢ结合，形成无活性的复合物而存在于细胞浆中。当细胞受到细胞因子或氧化应激刺激时，ΙκＢ被降解，释放出有活性的ｐ５０／ｐ６５二聚体，活化的二聚体进入细胞核，通过与相应的炎症因子靶基因启动子区的κＢ位点相结合而导致炎症因子基因的过度表达［１４］。研究表明，ＮＦ唱κＢ活化在类风湿关节炎的发病中起重要作用，类风湿关节炎患者滑膜组织中ＮＦ唱κＢ活性明显升高。ＴＮＦ唱α可刺激体外培养的成纤维样滑膜细胞中ＮＦ唱κＢ活化以及ＩＬ唱１β、ＩＬ唱６等促炎细胞因子分泌［９，１５］。类风湿关节炎动物模型研究也证实，抑制ＮＦ唱κＢ活化能够减轻关节炎的程度［１６］。ＮＦ唱κＢ活化是以ｐ５０／ｐ６５二聚体从胞浆转位到胞核为特征，因此本实验通过检测ｐ６５的核转位来间接评价ＮＦ唱κＢ的激活。结果显示，成纤维样滑膜细胞受ＴＮＦ唱α刺激后，ＮＦ唱κＢｐ６５在细胞核中表达增多，表明ＴＮＦ唱α可诱导ＮＦ唱κＢ的核转位，ＮＦ唱κＢ被活化。而羧胺三唑对ＴＮＦ唱α诱导的ＮＦ唱κＢｐ６５核转位具有显著抑制作用，提示羧胺三唑减少ＴＮＦ唱α诱导的ＩＬ唱１β、ＩＬ唱６等促炎细胞因子的产生可能与其抑制ＮＦ唱κＢ的活化有关。
综上所述，成纤维样滑膜细胞是羧胺三唑发挥作用的靶细胞之一，羧胺三唑可能通过抑制ＮＦ唱κＢ活化来减少ＴＮＦ唱α诱导的ＩＬ唱１β、ＩＬ唱６等促炎细因子的产生，这为将羧胺三唑开发成为类风湿关节炎的药物提供了依据。
参 考 文 献
［１］ ＰａｂｌｏｓＪＬ，Ｃａ鼻ｅｔｅＪＤ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙｏｆｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ．ＣｕｒｒＴｏｐＭｅｄＣｈｅｍ，２０１３，１３：７０５唱７１１．
［２］ ＬｅｆèｖｒｅＳ，ＫｎｅｄｌａＡ，ＴｅｎｎｉｅＣ，ｅｔａｌ．Ｓｙｎｏｖｉａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｓｐｒｅａｄｒｈｅｕ唱ｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓｔｏｕｎａｆｆｅｃｔｅｄｊｏｉｎｔｓ．ＮａｔＭｅｄ，２００９，１５：１４１４唱１４２０．［３］ 张品南，陈艳梅．类风湿关节炎的研究进展［Ｊ／ＣＤ］．中华临床医师杂志：电子版，２００８，２：１３０２唱１３０６．
［４］ ＭｏｏｄｙＴＷ，ＣｈｉｌｅｓＪ，ＭｏｏｄｙＥ，ｅｔａｌ．ＣＡＩｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．ＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ，２００３，３９：２７９唱２８８．
［５］ ＬａｍｂｅｒｔＰＡ，ＳｏｍｅｒｓＫＤ，ＫｏｈｎＥＣ，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅａｎｄａｎｔｉｉｎ唱ｖａｓｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏ唱ｔｒｉａｚｏｌｅｏｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．Ｓｕｒ唱
ｇｅｒｙ，１９９７，１２２：３７２唱３７８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ３７８唱３７９．
［６］ ＧｕｏＬ，ＹｅＣＹ，ＣｈｅｎＷＹ，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉ唱ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｎｄＡｎａｌｇｅｓｉｃＰｏ唱ｔｅｎｃｙｏｆＣａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ，ａＴｕｍｏｒｉｓｔａｔｉｃＡｇｅｎｔ．ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐ
Ｔｈｅｒａｐ，２００８，３２５：１０唱１６．
［７］ ＭｏｎｔｅｓｉｎｏｓＭＣ，ＹａｐＪＳ，ＤｅｓａｉＡ，ｅｔａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌｏｆｔｈｅａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａ唱ｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅｂｙｔｈｅｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｄｅｎｏｓｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒａｎ唱
ｔａｇｏｎｉｓｔｓｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅａｎｄｃａｆｆｅｉｎｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔｔｈｅａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅａｒｅｍｅｄｉａｔｅｄｖｉａｍｕｌｔｉｐｌｅａ
ｄｅｎｏｓｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
ｉｎｒａｔａｄｊｕｖａｎｔａｒｔｈｒｉｔｉｓ．ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ，２０００，４３：６５６唱６６３．
［８］ ＺｈｕＬ，ＷｅｉＷ，ＺｈｅｎｇＹＱ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｔｏｔａｌｇｌｕ唱ｃｏｓｉｄｅｓｏｆｐａｅｏｎｙｏｎｊｏｉｎｔｄａｍａｇｅｉｎｒａｔｃｏｌｌａｇｅｎ唱ｉｎｄｕｃｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｉｎ唱
ｆｌａｍｍＲｅｓ，２００５，５４：２１１唱２２０．
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ｍａｒｋｅｒｓｏｆｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄｃｏｌｌａｇｅｎａｎｄｃａｒｔｉｌａｇｅａｇｇｒｅ唱
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ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ，２００８，５８：３３６６唱３３７６．
（收稿日期：２０１３唱０５唱０２）
（本文编辑：戚红丹）
朱蕾，李娟，武丹威，等．羧胺三唑对ＴＮＦ唱α诱导的佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞中细胞因子分泌和ＮＦ唱κＢ活化的影响［Ｊ／ＣＤ］．中华临床医师杂志：电子版，２０１３，７（１１）：４８４９唱４８５３．
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