⼈⽩细胞介素6（IL-6）ELISA检测试剂盒
利路防水接头【双夹⼼酶联免疫定量法】
产品货号：ELSHIL06
声明：尊敬的客户，感谢您选⽤本公司的产品。本试剂盒仅供体外研究使⽤、不⽤于临床诊断!本试剂盒不含任何具有⽣物危害成分，但是试剂盒使⽤涉及的检测样本请在具有相应⽣物安全防护等级实验室进⾏，由此可能造成的所有⽣物安全危害由使⽤者⾃⾏负责。
本产品适⽤于体外定量检测⼈⾎清、⾎浆，细胞培养液或其它相关⽣物液体中⽩细胞介素6（IL-6）的含量。使⽤前请仔细阅读说明书并检查试剂组分！如有疑问，请及时。
特别说明：
1.打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整
2.⼀周内使⽤可存于4℃，需长时间保存或多次使⽤请按保存条件存放。
检测原理:
本试剂盒采⽤双抗体夹⼼ELISA法。⽤抗⼈IL-6抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的⼈IL-6会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加⼊⽣物素化的抗⼈IL-6抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗⼈IL-6抗体与结合在包被抗体上的⼈IL-6结合、⽣物素与亲和素特异性结合⽽形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加⼊显⾊底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝⾊，加终⽌液后变成黄⾊。⽤酶标仪在450nm波长处测OD值，IL-6浓度与OD450值之间呈正⽐，通过绘制标准曲线计算出样品中IL-6的浓度。注意：结构活性不佳的IL-6蛋⽩可能不容易被本试剂盒检出，例如原核重组表达的IL-6蛋⽩可能⽆法被试剂盒检出。 溶剂回收样品收集:
高钛渣1.⾎清：全⾎样品于室温放置2⼩时或4℃过夜后于1000×g离⼼20分钟，取上清即可检测，收集⾎液的试管应为⼀次性的⽆热原，⽆内毒素试管。
2.⾎浆：抗凝剂推荐使⽤EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离⼼15分钟，取上清即可检测。避免使⽤溶⾎，⾼⾎脂样品。
3.组织匀浆：⽤预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留⾎液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（⼀般按1:9的重量体积⽐，⽐如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加⼊蛋⽩酶抑制剂）加⼊玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进⼀步裂解组织细胞，可以对匀浆液进⾏超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离⼼5~10分钟，取上清检测。
4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离⼼20分钟，除去杂质及细胞碎⽚。取上清检测。
5.其它⽣物样品：1000×g离⼼20分钟，取上清即可检测。
6.样品应清澈透明，悬浮物应离⼼去除。
7.样品收集后若在1周内进⾏检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按⼀次使⽤量分装，冻存于-20℃(1个⽉内检测)，或-80℃（6个⽉内检测），避免反复冻融。
二次沉淀池8.如果您的样品中检测物浓度⾼于标准品最⾼值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先做预实验，以确定稀释倍
8.如果您的样品中检测物浓度⾼于标准品最⾼值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先做预实验，以确定稀释倍数）。
试验所需⾃备物品:
1.酶标仪(450nm波长滤光⽚)
2.⾼精度移液器，EP管及⼀次性吸头：0.5-10µL, 2-20µL, 20-200µL, 200-1000µL
3.37℃恒温箱，双蒸⽔或去离⼦⽔
4.吸⽔纸
检测前准备⼯作:
1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡⾄室温。
2.洗涤液配制：将浓缩洗涤液⽤双蒸⽔稀释(1:25)。未⽤完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可⽤40℃⽔浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使⽤时洗涤液应为室温）。当⽇使⽤。
3.标准品配制：浓度为500pg/mL 然后根据需要⽤通⽤稀释液进⾏1：2倍⽐稀释（注：不要直接在反应孔中进⾏倍⽐稀释）。建议配制成以下浓度：500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.81、0pg/mL，标准品&样品稀释液直接作为空⽩孔0pg/mL
4.⽣物素标记抗IL-6蛋⽩抗体⼯作液：实验前计算当次实验所需⽤量（以100µL/孔计），⽤通⽤稀释液稀释100倍，实际配制时应多配制100-200µL；
打包流水线5.链霉亲和素HRP⼯作液：实验前计算当次实验所需⽤量（以100µL/孔计），⽤通⽤稀释液稀释100倍，实际配制时应多配制100-200µL；
6.TMB底物液：使⽤前，提前放置室温平衡。
洗涤⽅法:
1.⾃动洗板机：每孔加⼊洗涤液350µL，注⼊与吸出间隔60秒。
2.⼿⼯洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸⽔纸上拍⼲，每孔加洗涤液350µL，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸⽔纸上拍⼲。
操作步骤:
实验开始前，各试剂均应平衡⾄室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。
1.加样：分别设空⽩孔、标准品孔、待测样品孔。空⽩孔加样品稀释液100µL，标准品孔分别加⼊依
次梯度稀释标准品，待测样品孔加待测样品100µL，给酶标板覆膜，37℃孵育60分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使⽤新的标准品溶液。
2.弃去孔内液体，甩⼲，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，⼤约350µL/每孔，甩⼲并在吸⽔纸上轻拍将孔内液体拍⼲。⽴即每孔加⼊配好的⽣物素标记的抗IL-6蛋⽩抗体⼯作液100µL（在使⽤前15 分钟内配制），注意不要有⽓泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育60分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使⽤新的标准品溶液。
3.弃去孔内液体，甩⼲，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，⼤约350µL/每孔，甩⼲并在吸⽔纸上轻拍将孔内液体拍⼲；
4.⽴即每孔加⼊配好的链霉亲和素HRP⼯作液100µL（在使⽤前15分钟内配制），注意不要有⽓泡，加样时将样品加于
4.⽴即每孔加⼊配好的链霉亲和素HRP⼯作液100µL（在使⽤前15分钟内配制），注意不要有⽓泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育45分钟;
5.弃去孔内液体，甩⼲，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，⼤约350µL/每孔，甩⼲并在吸⽔纸上轻拍将孔内液体拍⼲；
6.每孔加TMB底物溶液(TMB)100µL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右（根据实际显⾊情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终⽌）。
7.每孔加终⽌液100µL，终⽌反应，此时蓝⾊⽴转黄⾊。终⽌液的加⼊顺序应尽量与底物液的加⼊顺序相同。
8.⽴即⽤酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
9.实验完毕后将未⽤完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存⾄有效期结束。
注意事项：
1.保存：试剂盒中各试剂请按说明书提⽰合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须旋紧以防⽌蒸发和微⽣物的污染，否则可能会出现错误的结果。
2.酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许⽔样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。暂时不⽤的板条应拆卸后放⼊备⽤铝箔袋，按推荐温度存放！
3.加样：加样或加试剂时，第⼀个孔与最后⼀个孔的加样时间间隔如果太⼤，将会导致不同的“预温育”
时间，从⽽明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间最好控制在10分钟内。推荐设置复孔。
4.温育：为防⽌样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜；洗板后应尽快进⾏下步操作，避免酶标板处于⼲燥状态；严格遵守给定的温育时间和温度。
5.洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸⽔纸上拍⼲，勿将滤纸直接放⼊反应孔中吸⽔。在读数前要注意清除底部残留的液体和⼿指印，以免影响酶标仪读数。
6.显⾊时间的控制：加⼊底物后请定时观察反应孔的颜⾊变化（⽐如每隔5分钟），如梯度已很明显，请提前加⼊终⽌液终⽌反应，避免颜⾊过深影响酶标仪读数。
7.底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
8.混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使⽤微量振荡器(使⽤最低频率)，如⽆微量振荡器，可在反应前⼿⼯轻轻敲击酶标板框混匀。
9.安全：试验中请穿着实验服并带乳胶⼿套做好防护⼯作。特别是检测⾎液或者其他体液样品时，请按国家⽣物试验室安全防护条例执⾏。
10.不同批号的试剂盒组份不能混⽤（洗涤液和反应终⽌液除外）
11.试验中所⽤的EP管和吸头均为⼀次性使⽤，严禁混⽤，否则将影响试验结果！
结果判断:
1.以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。如有设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。
2.推荐使⽤专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界⾯既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代⼊标准曲线的拟合⽅程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3.若样品OD值⾼于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
灵敏度、检测范围、特异性和重复性:
箱包手把
●灵敏度：最⼩可测4.69pg/mL。
●检测范围：7.81-500pg/mL。
●特异性：与其它蛋⽩⽆交叉反应。
●重复性：板内，板间变异系数均<10%。
试剂盒说明：
检测过程中可能出现检测值过⾼超过试剂盒检测范围，此时应该进⼀步稀释样本重新实验。
*本试剂仅供实验室研究使⽤
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