tunnel

罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序

（In situ cell death detection kit-POD法）

一、 原理：

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜反应（呈深棕），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、 器材与试剂

器材：光学显微镜及其成像系统、小型染缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及头等；

试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5

μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM

Tris/HCl， pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，

10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

三、 实验步骤

操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显→光学显微镜计数并拍照。

具体操作步骤：

1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；

2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；

3. PBS漂洗2次；

4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液8min；

5. PBS漂洗2次；

6. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。

7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。

8. PBS漂洗3次；

9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；

10. 玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。

11. PBS漂洗3次；

12. 在组织处加50~100μlDAB底物，反应15~25℃×10min；

13. PBS漂洗3次；

14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染细胞呈现染质浓缩、边缘化，核膜裂解，染质分割成块状/凋亡小体）

四、 注意事项

1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。

2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。

3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。

4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。

5. 如果20×DAB 溶液颜变深成为紫，则不可使用，需重新配制。

6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸 PH4.0）染后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱，注意快速进行脱水操作。

7. 荧光素标记的dUTP液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。

8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。

9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN**断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果.

品牌：建成

型号：D002

包装规格：可染20~30张片

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产品性状：液体

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生产厂家：南京建成

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【产品介绍】 本试剂盒主要用以骨髓细胞涂片及血液细胞涂片染检查，可鉴别T-淋巴细胞和B-淋巴细胞，前者多为阳性，而后者为阴性。染后细胞浆内可见棕或棕黑颗粒或片状沉淀，为阳性反应。具有简易、快速、保质期长，结果易于观察和判断等优点。

【染原理】在酸性的缓冲液中，细胞内酸性磷酸酶催化底物水解，其生成物进而与一种稳定的重氮盐偶联，生成不溶性的偶氮染料沉淀。

【染结果】细胞核呈紫蓝（苏木素复染）或绿（甲基绿复染），阳性者胞浆中出现红至红棕颗粒，有些为棕褐或咖啡颗粒。

【所需仪器】光学显微镜、玻片、染缸、滴管、秒表、记号笔等。

【产品优点】

① 磷酸酶系列染液为重氮偶联法，染效果好，磷酸酶的特异性反应沉着于胞浆当中，形成红或红棕的颗粒沉淀。再通过核染液的复染，对比度清晰、分明。

② 染液无嗅、无味、无刺激、不脱，不含有毒性的物质，对人体无伤害。

③ 操作步骤简单，只需固定—底物液孵育—复染三步，省时、准确、操作简便。

④ 染建议使用水性介质-甘油明胶进行封片固定。

⑤ 该磷酸酶系列染液均使用进口原料，质量保证，价格低廉，特别是抗酒石酸酸性磷酸酶染液，为国内独家生产，物美价廉。