细菌的革兰氏染及染液的配制

革兰氏染的一般步骤

革兰氏染法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

革兰氏染属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染1分钟后水洗，然后加革兰碘液媒染一分钟后用酒精脱，再用稀释石炭酸复红复染。染后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱而保留紫者为革兰氏阳性菌（G）。被酒精脱复染成红者为革兰氏阴性菌（Gˉ）。

革兰氏染原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄葡萄球菌、绿溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、杆菌等属革兰氏染阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌（大肠埃希菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性菌。所以根据细菌的革兰氏染性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染尚可做为选用抗生素的参考。

革兰氏染法一般包括初染、媒染、脱、复染等四个步骤，具体操作方法是：

1）涂片固定。

2）草酸铵结晶紫染1分钟。

3）纯化水冲洗。

4）加碘液覆盖涂面染1分钟。

5）水洗，用吸水纸吸去水分。

6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱，30秒后水洗，吸去水分。

7）番红染液（稀）染10秒钟后，纯化水冲洗。干燥，镜检。

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染的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫，负反应菌体都呈红。

实验三 细菌的革兰氏染法

一、目的要求

了解革兰氏染的原理，学习并掌握革兰氏染的方法。

二、基本原理

革兰氏染反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染反应呈蓝紫的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染反应呈红（复染颜）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱，因此，呈现蓝紫；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱，然后又被染上了复染液（番红）的颜，因此呈现红。

革兰氏染需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱剂（decoorising agent）和复染液（counterstain）。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染的初染液一般是结晶紫（crysta vioet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱剂是将被染的细胞进行脱，不同类型的细胞脱反应不同，有的能被脱，有的则不能，脱剂常用95％的酒精（ethano）。复染液也是一种碱性染料，其颜不同于初染液，复染的目的是使被脱的细胞染上不同于初染液的颜，而未被脱的细胞仍然保持初染的颜，从而将细胞区分成G+和G-两大类，常用的复染液是番红。

三、器材

大肠杆菌，金黄葡萄球菌；

草酸铵结晶紫，番红水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。

四、操作步骤

1．涂片

将培养24小时的金黄葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2．染

（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

（3）脱：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。

（4）复染：用番红液染1～2分钟，水洗。

（5）镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红，革兰氏阳性菌呈紫。以分散开的细菌的革兰氏染反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄葡萄球菌混合制片，作革兰氏染对比。

注意：革兰氏染的关键在于严格掌握酒精脱程度，如脱过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

五、实验结果与讨论

微生物染液的配制

一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液

A液：美蓝(methylene blue) 0．6g

95%酒精 30ml

B液：KOH 0．01g

蒸馏水 100ml

分别配制A液和B液，配好后混合即可。

二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染液

A液：碱性复红(basic fuchsin) 0．3g

95%酒精 10ml

B液：石炭酸 5．0g

蒸馏水 95ml

将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。

将石炭酸溶解于水中，配成B液。

混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释5—10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。

三、革兰氏(Gram)染液

1．草酸铵结晶紫染液

A液：结晶紫(crystal violet) 2g

95%酒精 20ml

B液：草酸铵(ammonium oxalate) 0．8g

蒸馏水 80ml

混合A、B二液，静置48小时后使用。

2．卢戈氏(Lugol)碘液

碘片 1．0g

碘化钾 2．0g

蒸馏水 300ml

先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。

3．95%的酒精溶液(脱用)。

4．番红复染液

番红(safranine O) 2．5g

95%酒精 100ml

取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。

四、芽孢染液

1．孔雀绿染液

孔雀绿(malachite green) 5g

蒸馏水 100ml

2．番红水溶液

番红 0．5g

蒸馏水 100ml

3．苯酚品红溶液

碱性品红 11g

无水酒精 100ml

制法取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用。

4．黑素(nigrosin)溶液

水溶性黑素 10g

蒸馏水 100ml

称取10g黑素溶于100ml蒸馏水中，置沸水浴中30分钟后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，加0．5ml甲醛，备用。

五、荚膜染液

1．黑素水溶液

黑素 5g

蒸馏水 100ml

福尔马林(40%甲醛) 0．5ml

将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，然后加入福尔马林作防腐剂。

2．番红染液

与革兰氏染液中番红复染液相同。

六、鞭毛染液

A液：单宁酸 5g

FeCl3 1．5g

蒸馏水 100ml

福尔马林(15%) 2．0ml

NaOH(1%) 1．0ml

配好后，当日使用，次日效果差，第三日则不宜使用。

B液：AgNO3 2g

蒸馏水 100ml

待AgNO3溶解后，取出10ml备用，向其余的90mlAgNO3中滴入浓NH4ON，使之成为很浓厚的悬浮液，再继续滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的10mlAgNO3慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈雾不重，此染剂可使用一周，如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用。

七、富尔根氏核染液

1．席夫氏(Schiff)试剂

将1g碱性复红加入200ml煮沸的蒸馏水中，振荡5分钟，冷至50℃左右过滤，再加入1mol/LHC120ml，摇匀。待冷至25℃时，加Na2S2O5(偏重亚硫酸钠)3g，摇匀后装在棕瓶中，

用黑纸包好，放置暗处过夜，此时试剂应为淡黄(如为粉红则不能用)，再加中性活性炭过滤，滤液振荡1分钟后，再过滤，将此滤液置冷暗处备用(注意：过滤需在避光条件下进行)。

在整个操作过程中所用的一切器皿都需十分洁净、干燥，以消除还原性物质。

2．Schandium固定液

A液：饱和水溶液

50ml水溶液加95%酒精25ml混合即得。

B液：冰醋酸

取A液9毫升+B液1毫升，混匀后加热至60℃。

3．亚硫酸水溶液

10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml，1mol/LHCl5ml，加蒸馏水100ml混合即得。

八、Bouin氏固定液

饱和水溶液 75ml

福尔马林(40%甲醛) 25ml

冰醋酸 5ml

1g可制成75ml饱和水溶液。

先将溶解成水溶液，然后再加入福尔马林和冰醋酸摇匀即成。

九、乳酸石炭酸棉蓝染液

石炭酸 10g

乳酸(比重1．21) 10ml

甘油 20ml

蒸馏水 10ml

棉蓝(cottonblue) 0．02g

将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其溶解即成。

十、 瑞氏(Wright)染液

瑞氏染料粉末 0．3g

甘油 3ml

甲醇 97ml

将染料粉末置于干燥的乳缽内研磨，先加甘油，后加甲醇，放玻璃瓶中过夜，过滤即可。

十一、美蓝(Levowitz-Weber)染液

在52ml95%酒精和44ml四氯乙烷的三角烧瓶中，慢慢加入0．6g氯化美蓝(met hylene

blue chloride)，旋摇三角烧瓶，使其溶解。放5—10℃下，12—24小时，然后加入4ml冰醋酸。用质量好的滤纸如WhatmanNo．42或与之同质量的滤纸过滤。贮存于清洁的密闭容器内。

图片-铜绿假单胞菌

金黄葡萄球菌-显微图片

破伤风梭菌

大肠杆菌

志贺菌革兰染

伤寒沙门菌革兰染

念球菌病直接镜检 结核分枝杆菌

肉毒杆菌

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