[笔记]革兰氏染实验总结

[笔记]革兰氏染实验总结

革兰氏染法

革兰氏染法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染法，1884年由丹麦医师、细菌学家 Christain Gram创立。

细菌先经碱性染料结晶染，而经碘液媒染后，用酒精脱，在一定条件下有的细菌此不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌(G+)，后者为革兰氏阴性菌(G—)。为观察方便，脱后再用一种红染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。阳性菌仍带紫，阴性菌则被染上红。有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应;弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感。可根据革兰氏染法鉴别不同菌种并对症下药。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱，这是染反应的主要依据。 另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应;PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱，阴性菌透性大，易脱。所以脱时间，脱方法也应严格控制。

G，菌:细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫。

Gˉ菌:肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红。

革兰氏染法一般包括初染、媒染、脱、复染等四个步骤，具体操作方法是:

,)涂片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。

,)草酸铵结晶紫染1分钟。

,)自来水冲洗，去掉浮。

,) 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

,)用中性脱剂如乙醇(95%)或丙酮酸脱30秒，革兰氏阳性菌不被褪而呈紫，革兰氏阴性菌被褪而呈无。

,)用蕃红染液复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫，革兰氏阴性菌则呈现红。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。

实验四 革兰氏染法

一、目的要求

了解革兰氏染的原理，学习并掌握革兰氏染的方法。

二、基本原理

革兰氏染反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区

+分为两大类:染反应呈蓝紫的称为革兰氏阳性细菌，用G表示;染反应呈红

-(复染颜)的称为革兰氏阴性细菌，用G表示。细菌对于革兰氏染的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染过程中，当用乙醇处理时，由于脱水

而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱，因此，呈现蓝紫;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱，然后又被染上了复染液(番红)的颜，因此呈现红。

革兰氏染需用四种不同的溶液:碱性染料(basic dye)初染液;媒染剂(mordant);脱剂(decolorising agent)和复染液(counterstain)。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘(iodine)是常用的媒染剂。脱剂是将被染的细胞进行脱，不同类型的细胞脱反应不同，有的能被脱，有的则不能，脱剂常用95,的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜不同于初染液，复染的目的是使被脱的细胞染上不同于初染液的颜，而未被脱的细胞仍然保持初染的颜，从而将细胞区分成G+和G-两大类，常用的复染液是番红。

三、器材

大肠杆菌，枯草芽孢杆菌;

革兰氏染液，载玻片，显微镜等。

四、操作步骤

1(涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚)，干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2(染

(1)初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

(2)媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

(3)脱 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95,酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。

(4)复染 用番红液染1—2分钟，水洗。

(5)镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红，革兰氏阳性菌呈紫。以分散开的细菌的革兰氏染反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

(6)同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染对比。

革兰氏染的关键在于严格掌握酒精脱程度，如脱过度，则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

五、实验报告

1(结果

在你所作的革兰氏染制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何,它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌,

2(思考题

)作革兰氏染涂片为什么不能过于浓厚,其染成败的关键一步是什么, (1

A: 会呈假阳性;脱时间把握准确。

(2)当你对一株未知菌进行革兰氏染时，怎样能确证你的染技术操作正确，结果可靠,

A: 非别两种已知的G+和G-菌，用完全一致的手段对其操作染，若镜检结果与已知事实相符，则此时可认为染操作是正确的，结果是可靠的。

附录:显微镜油镜的使用

1、用低倍镜对光。

2、低倍镜观察(寻观察目标)。

3、高倍镜观察(选取理想的观察目标)。 4、油镜观察:高倍镜观察后----上升镜微--油镜转至正下方在载玻片上加一小滴香柏油

--小心地下降镜微使镜头浸在油里----用粗螺旋将镜微缓慢上升，寻目标(物象)--

--用螺旋调节，使物象清晰----观察记录。 5、观察完毕。上升镜筒转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的油

迹，最后再用擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。 6、将显微镜各部分还原，放回箱中。 思考:油镜完毕后，镜头应如何处理?