基于CRISPRCas系统的单碱基编辑技术研究进展

中国生物工程杂志 China Biotechnology,2020,4〇( 12) :58七6D01：10. 13523/. 2007051i综

：

乂一 ♦ •• +

一 ♦ — + — + —卜—述ij♦

一 >基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展王玥牟彦双#刘忠华(东北农业大学黑龙江省动物细胞与遗传工程重点实验室哈尔滨150030)摘要基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编

辑，其原理是将胞嘴咬脱氣酶（cytosine

deaminase)或腺香脱氣酶（adenosine

deaminase)与Cas9n

(D10A)形成融合蛋白，通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后，利用胞嘧啶脱氨

酶或腺苷脱氣酶将把点距离sgRNA位点基序（protospacer

adjacent

motif,PAM)序列端的4 ~7位

的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组

成和分类、工作原理进行了概述，并总结了该系统最新进展及应用。关键词

CRISPR/Cas9

基因编辑单碱基编辑胞嘧啶脱氨酶腺苷脱氨酶

中图分类号Q789CRISPR/Cas 系统（clustered regularly interspaced

short palindromic repeats/ CRISPR-associated)是一■种由

RNA指导的Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰

的技术，它是细菌和古生菌为了应对噬菌体和外源质粒

的不断攻击而演化出的获得性免疫防御机制。包含间隔

重复序列的微生物基因组位点被命名为CRISPR 1。

CRISPH/Cas9 系统可利用同源重组（homology dependent

repair，HDR)进行单个碱基的替换，但针对单个碱基突变

的基因修正效率较低[2]。主要原因为DNA双链断裂时，

虽然同源重组能引人精确的突变，但是其碱基替换效率

仅为0. 1% ~5%[3'因而基因组I)NA更倾向于利用非

同源末端修复（non-homologous end joining, HENJ)对

DNA进行修复。而单碱基编辑技术是利用单碱基编辑

系统在不引起DNA断裂和无需DNA模板下，实现了高

效的单个碱基的替换编辑。单碱基编辑技术自出现以

来，即展现出其高精度以及简便高效的特点，成为基因

突变遗传性疾病的潜在工具之一。l单碱基编辑技术介绍1.1 CBE碱基编辑器胞嘧啶碱基编辑器（CBE)—般由CaS9n或dCas9

与胞嘧啶脱氨酶组成（图la)。胞嘧啶碱基编辑器的生

物化学原理是利用胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶糖基化酶抑

制子将胞嘧啶(C)的氨基去除，从而使得胞嘧啶（C)变成

尿嘧啶（U)(图lb)。胞嘧啶碱基编辑器的工作原理是

当CBE融合蛋白在sgRNA的引导下靶向基因组DNA

时，胞嘧啶脱氨酶可结合到由Cas9蛋白、sgRNA及基因

组DNA形成的R-l〇〇p区的单链DNA(ssDNA)处，将

SSDNA上一定范围内的胞嘧啶（C)经过脱氨基作用形成

尿嘧啶（U),进而通过DNA修复或复制将尿嘧陡（U)转

变为胸腺嘧啶(T),最终实现胞嘧啶（C)到胸腺嘧陡（T)

的碱基替换（图lc)[5:,实现单碱基高效精准编辑。1.2 ABE碱基编辑器ABE碱基编辑系统是将腺什脱氨酶与CR1SPR/Cas9

融合，实现A至G的碱基编辑（图2a)[6]，其生化过程是利

用脱氨酶将胞嘧啶(C)或腺嘌呤（A)上的氨基去掉，分别

收稿日期:202(W)7-30

修回日期:20204)9-24转换为尿嘧啶(U)或次黄嘌呤（I)，通过l)NA复制或修复

时将两者转换为胸腺嘧啶(T)或鸟嘌呤(G)(图2b)。ABE

碱基编辑器是利用可以直接对DNA上腺嘌呤进行脱氨作

用的TadA突变体，与Cas%(

D10A)融合，构建直接作用于*转基因生物新品种培育科技重大专项（20167.X08009 -003 -

006)、国家重点研发计划（2016YFA0100200)、黑龙江省自然科学基

金联合引导项目（LH2020C016)资助项目

**通讯作者，

：muyanshuang@ neau. edu. cn

2020,40(12)王玥等:基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展59APOBEC1LCas9nLUGI(a)dCas9Cytidinedeaminase5,3,3,…Genomic DNA-…5,Base-edited DNADNA

replication

or repair3，..5，.(c)图1 CBE系统原理示意图Fig. 1 Schematic diagram of the function in CBE system(a) Deaminase-mediated base editing reactions

(c) Cytosine base editing strategy

( b) The schematic structure of cytosine ( CBE, take BE3 as an example) base editors

L： Peptide linkerSSDNA的高效诱导腺嘌呤（A)到鸟嘌呤（G)转变的

ABE系统，从而实现对靶点的碱基替换（图2c):6]。1.3 CBE和ABE双碱基编辑器确RNA编辑的CRISPR系统即REPAIR系统，它是利

用ADAR2的脱氨基结构域（ADARDD)与Casl3b相融

合组成的，可实现单链RNA中单个碱基C到U的编

辑。尽管相对于RNAi系统，REPAIR系统的碱基编辑

更精确，但是仍存在大量的脱靶现象。之后.Abudayyeh

等(9进一步优化REPAIR系统，将系统中的ADAR2换

为胞苷脱氨酶，构建了胞苷脱氨酶功能的ADARDD与

Casl3b相融合的RESCUE系统（图4)，RESCUE系统

保留了从腺嘌呤（A)到次黄嘌呤（I)的编辑活性，可实

现从C到U和从A到I的多重编辑。RESCUE系统与

REPAIR系统相比，脱靶率减少，同时降低靶向目标编

辑效率。利用RESCUE系统可实现编码蛋白质功能的2020年，Grunewald等:7]为实现基因的双向碱基编辑，

将腺苷脱氨酶(TadA)、胞嘧啶脱氨酶(PmCDAl)分别融合

到Cas9n的N端和C端。开发出了一种基于CRISPR/

Cas9的可以同步对腺嘌呤和胞嘧啶进行编辑的双碱基编

辑器（图3)。双碱基编辑器的C-T编辑效率与CBE相

当，对A-G编辑效率则略有降低,但双碱基编辑器的总

体碱基编辑效率高于单独的CBE和ABE系统:7]。1.4 RNA单碱基编辑器2019年，Abudayyeh等w建立了第一个能够实现精

60中国生物工程杂志China BiotechnologyVol.40 No. 12 2020(a)Adenine(b)DearainateHypothetical

deoxyadenos ine

deaminase .IIIQIIIIIIIIIIIIII—5,…3,r’丨丨丨liiii

训 ini

丨iinmMnn:Genomic DNA(c)c"jllllillallllllllllllllllllllllL"vBase-edited DNA1DNA repair or

replication图2 ABE系统原理示意图Fig. 2 Schematic diagram of the function in ABE system(a) Deaminase-mediated base editing reactions

L： Peptide linker( b)The schematic structure of adenine ( ABE) base editors ( c) Adenine base editing strategy

ADARdd dCasl3b guide RNA、«

M

ntarget A specifiedby mismatching Con guide RNA图4 RESCUE系统用pre-crRNA弓|导阵歹ij对

C到U和A到I进行多重编辑的示意图

Fig. 4 Schematic of multiplexed C to U and A

to I editing with pre-crRNA guide arrays图3双碱基编辑原理示意图

Fig. 3 Schematic diagram of the function

in Dual base editing system2单碱基编辑系统的优化单碱堪编辑器出现后主要针对提高编辑器的编辑

KNA特定碱基位点改变，扩展了单碱基基因编辑技术

的应用领域9。效率和减少脱靶效应两方面进行优化改进、2019年，

■^等> 在水稻中的研究发现BE3和HF1-BE3两个

CBE碱基编辑器在全基因组范围内存在脱靶编辑，而

2020,40(12)王玥等:基于CmSPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展61ABE却没有脱靶现象，并且CBE引发的突变数量大约

是自然环境下发生突变的2倍。2019年,Zu。等:"]在

小鼠中利用二细胞胚胎注射技术建立了检测全基因组

内脱靶效应的新型脱靶检测技术，结果发现小鼠中使

用单碱基编辑技术存在脱粑效应，所以需要进一步优

化CBE系统，增加单碱基编辑器的特异性。2.1 CBE系统的优化第一代碱基编辑器（BE1)是将大鼠胞嘧啶脱氨酶

(APOBEC1)通过一个16个氨基酸长度的XTEN接头

(XTEN linker)连接到dCas9蛋白上5，它可以在靶基

因 PAM( protospacer adjacent motif)序列 NGG 上游 16 ~

19位实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换。第二代碱基编辑器（BE2)是在BE1碱基编辑器的

基础上融合尿嘧啶DNA糖苷酶抑制蛋白（uracil DNA

glycosylase inhibitor, UGI)形成的。BE2 比 BE丨提高了

编辑效率并且抑制细胞DNA链中尿嘧啶（U)的切除修

复，同样通过I)NA复制实现胞嘧啶（C)到胸腺嘧啶

(T)的转换，编辑效率最高可达到20%左右1121。但是，

对于BE1和BK2碱基编辑器来说;5]，都是存在脱靶效

应的。第三代碱基编辑器（BE3)将之前的碱基编辑器中

的

链，即靶向链il3],可保持编辑链完整性[14@。BE3可以

防止UDG催化形成无碱基位点（AP位点）。BE3可

将碱基编辑效率提高到50%并且降低了脱靶效应u:。2〇17年，Carter等利用一种含有高保真度Cas9

变异体（HF-Cas9 )取代dCas9构建出的新一代碱高保

真碱基编辑器（HF-BE3)。HF-BE3碱基编辑器减少与

碱基编辑相关的脱靶效应，脱靶编辑比BE3少了

37%[,6]0第四代碱基编辑器（BE4)是在BE3基础上进一步

优化连接（linker)序列，同时增多一个拷贝的UGI而形

成的:17:。BE4显示出比BE3:15:更高的编辑效率，并且

具有更大的编辑活性窗口[18]。BE4在编辑过程中不产

生双链DNA断裂，仅需一个DNA单链切口就能实现

单碱基精准编辑，可有效避免编辑过程产生基因组损

伤:3](图 5)。2.2 CBE系统的改造2016年，Nishida等:18:将来源于七鳃鳗的胞嘧啶脱

氨酶与CmSPR/Cas9和UGI融合形成dCas9-gRNA和

PmCDAl复合物，即Cas9n-AID碱基编辑器。可在哺乳

动物细胞中实现15% ~55%耙向突变。2016年，MaBE1 AP0BEC1 I 16aa| SpCas9n(D10A,H840A)BE2 AP0BEC1 16aa | SpCas9n(D10A，H840A4 4aa ~| es Cas9nUGIHF-BE3 | AP0BEC1 | 16aa I ~HF Cas9n (D10A) | 4aa ~| UGIBE4 | AP0BEC1 | 32aa | Cas9n (D10A) [ UgT[ 9aa | UGI图5 BE碱基编辑系统版本汇总

Fig. 5 Summary of BE editing system version等[l9]将人源胞嘧啶脱氨酶（hAID)的C端去除得到

AIDx,将dCas9与AIDx进行融合开发了 -种Targeted

AID-mediate(丨 mutagenesis (TAM)，可在距离 PA1VI 的 5

~9位碱基产生C到T、A、G的突变。而后将来源于人

的胞嘧啶脱氨酶突变体去除出核定位信号后融合到

MS2蛋白上，通过MS2 RNA的发夹结构招募到sgRNA

的骨架中，经优化后形成CR丨SPR-X(图6),可以在+

20〜+4〇bp窗口内实现平均20. 6%的突变效率[2°]。图6 CRISPR-X工作原理图

Fig. 6 The working principle diagram of CRISPR-X2017年，Kim等[211通过胞嘧啶脱氨酶功能域进行

氨基酸突变（W90Y + R126E)建成YE1-BE3碱基编辑

系统，YE1-BE3碱基系统在保持与BE3相似编辑活性

的同时，编辑窗口更为精确。将Cpfl与AP0BEC1进

行融合，由于Cpfl的特殊结构，无法设计成切口靶向

链,而将非靶向链暴露给脱氨酶，因此，最初的Cpfl-

Apobecl效率并不高，与TALE-AID类似。2018年，Li

等[22:通过将核定位信号引人Cpfl-Apobecl对剪辑编

辑器进行改造形成dCpfl-Bes,该系统编辑效率最高可

达 40% (图 7)。在BE3基础上通过自剪接多肽-2A表达多个游离

的UGI,开发了 eBE-S3_23:(图8 )。在胞嘧啶发生脱氨

62中国生物工程杂志China BiotechnologyVol.40 No. 12 2020YEE-BE3碱基编辑系统将具有不同PAM识别能

力的Cas9 (如spCas9和saCas9 )引人，同时通过突变

AP0BEC1特定的氨基酸形成不同的突变体，突破NGG

序列限制，使突变窗口缩小为1或2个,使其靶向突变

更为精确™。YE1-BE3-FNLS[24的原理是在不影响催化活性的

情况下，突变AP0BEC1上的ssDNA结合结构域相应氨

基酸,从而显著降低DNA脱靶效，显著提高了基因编

辑效率（图9)。BE3 Engineered BE3图7 dCpfl-BEs工作原理图

Fig. 7 The working principle diagram of dCpfl-Bes基时会刺激细胞内的切除修复，虽然在碱基编辑过程

中不可避免的产生较低频的插人缺失及非预期突变（C

到G,A的突变），但是eBE-S3与BE4 —样，均可以不

同程度地降低插人缺失及非预期突变[23]。pCMV

图9 YE1-BE3-FNLS工作原理图

Fig. 9 The working principle diagram of YE1-BE3-FNLS2.3提高精确度的hyCBE单碱基编辑系统AA11

Cas9nCa?UGI2A| UGI2AUG1 | 2a| UG1 )—hyCBE碱基编辑系统通过对10个非序列特异性的

ssDNA结合结构域（ssDBD)与CBE进行融合，将Rad51

蛋白的ssDBD融合到AP0BEC1与Cas9n之间，大幅增

加编辑窗口且能显著提高碱基编辑活性（图l〇a)。通过

10个耙点的分析，在编辑窗口 C4 ~C8中,hyBE4max比

BE4max活性提高丨•

5 ~ 2倍（图10b)，而在C9 ~ C15这

些更靠近PAM的碱基中，活性最多可提高18倍[25]。BE4maxNLSrAlSpCas9neBE-S3图8 eBE-S3结构示意图

Fig. 8 The structure diagram of eBE-S3UGI | UGINLSN-ss DBD-BE4raaxRad51DBDm-BE4max (hyBE4raax)NLSrAlRad51DBDSpCas9n(b)UGIUGINLS(a)图10 hyCBE碱基编辑系统原理图

Fig. 10 Schematic diagram of the function in hyCBE system(a) The working principle diagram of hyCBE ( b) The schematic diagram of the optimization of hyCBE system

2020,40(12)王玥等:基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展632.4 ABE碱基编辑器的优化如今已经开发了几种版本的ABE,从ABE1.2发展

至ABE7. 10”。第一代ABE碱基编辑器是利用能直接

TadA上的3个新的点突变位点L84F、H123Y和丨157F

引入ABE2. 9得到ABE3. 1,效率可提高至29% ±

2.6% ;将 TadA 上的 4 个点突变 H36L、R51L、S146C 和

K157N引人ABE3. 1得到ABE5. 1，通过大肠杆菌抗性

筛选体系进一步优化了 TadA序列，虽能在细菌产生高

效定点突变，但是在哺乳动物细胞中的突变效率却降

低了;将ABE5. 1两个TadA亚基中N端无催化功能的

亚基替换为wtTadA,形成ABE5. 3编辑系统，将编辑效

率提升至22% ~ 33%; ABE6. 3通过已有突变的重新组

合，以去除不利编辑效率达47% ±5. 8% (表1 );

ABE7. 10编辑系统继续引人突变以解决上述问题，其

编辑效率显著提高,在人类细胞中编辑效率约为50% ,

还可保证极高的精确度和较低的脱靶效应[6](图11 )。作用于DNA的突变体TadA"1 (D108N和A106V)构建

而成的，命名为ABE1.2,但在哺乳动物细胞中的碱基

编辑效率非常低，仅为3.2%;在ABE1.2基础上继续

通过随机文库筛选新的突变位点，将TadA上的2个点

突变D147Y和E155V引人ABE1.2,构建出ABE2.1系

统，碱基编辑效率提高到11%。接下来，在ABE2. 1系

统中融合表达wtTadA或TadA(2.

1广，分别构建出

ABE2.9和ABE2. 10,由于TadA以同源二聚体的形式

发挥作用，其中一个TadA催化脱氨，而另一个TadA作

为催化底物tKNA有关位点，ABE2. 9能将编辑效率有

效提升至24%左右；在此基础上进一步引人突变，将表1 ABE碱基编辑系统优化表Table 1 Table of the optimization of ABE systemABE versionABE1.2ABE2. 1ABE2.9ABE2. 10ABE3. 1ABE5. 1ABE5.3ABE6.3ABE7. 10DeaminaseTadA*TadA*TadA*TadA(2. 1) •TadA • -TadA *wtTadA-TadA *wtTadA-TadA *wtTadA-TadA *wtTadA-TadA *Point mutationD108N、A106VD147Y、E155VD147Y、E155VD147Y、E155VL84F、H123Y、I157FH36L、R51L、S146C、K157NH36L、R51L、S146C、K157NRemoval of adverse point mutationsRemoval of adverse point mutationsBase editing rate ( % )3.21120通过在ABE7. 10中利用nxCas9替换CaS9n。开发

了

xABE系统将ABE的靶向PAM序列范围扩展到

了包含NG、GAA或GAT的基因组区域。其他新的

ABE碱基编辑系统利用其他具有改变的PAM特异性

ABE1.2TadA* I Linker I Cas9nCas9nNLSNLSCas9nCas9nCas9nCas9nCas9nNLSNLSNLSNLSNLSABE2.1I—TadA*~PLinker I

ABE2.9

I~TadA* I Linker I ~TadA* [ linkerABE3.1

ABE5.1ABE6.3ABE7.10的Cas9变体（即VQR和VRER)，可分别识別PAM序

列NGA和NGCG。其中包含SpCas9或SaCas9以及含

SaKKHCaS9的工程化形式的ABE,都可以在PAM序列

TadA* I Linker! TadA* I Linkrr

^iTadA I Linker] TadA* I Linker「wtTadA Linkdrj TadA* | Linker |

中包含NNGRRT和NNNRRT的区域进行碱基编

辑。对ABE7. 10应用了密码子优化和附加的核定

位信号（NLS)策略，与ABE7. 10相比，新型的ABEmax

具有更高的编辑效率:3°]。wtTadA I Linker 1 TadA* 1 I inkerl

3单碱基编辑系统的应用图11 ABE碱基编辑系统优化图

Fig. 11 Schematic diagram of the

optimization of ABE systemYellow stars indicate 10 mutation sites； red stars indicate 1 mutation site3.1单碱基编辑与基因肿瘤疾病研究中，利用dCas9-AIDx碱基编辑

系统，解决肿瘤疾病过程中，基因上特定位点的碱

64中国生物工程杂志China BiotechnologyVol.40 No. 12 2020基突变会使部分肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生的耐药

性，建立了基于dCaS9-AIDx系统下筛选肿瘤耐药突变

的新方法。例如，在慢性髓系白血病

(chronicmyloiclleukemia，CML)患者的中，抑制癌细

胞中BCR-ABL激酶的活性，从而抑制白细胞的过度增

殖[3丨]。动物疾病中，2020年，Yeh等#利用双AAV

载体递送单碱基编辑器，成功恢复7>nc/基因隐性突变

用，为开展安全有效的干细胞提供了可能的解决

途径。2020年，Wang等™通过优化的单碱基编辑技术

编辑P-地中海贫血和镰刀状贫血患者造血干细胞中的

BCL11A增强子位点，或者直接修复发生突变的Wfi/?

基因，并进行自体造血干细胞移植，可以使其在体内分

化产生具有正常功能血红蛋白的红细胞，由P-

globin珠蛋白突变引发的系列遗传疾病。导致的完全耳聋小鼠的听力，经过单碱基编辑的

小鼠具备完好的耳毛细胞形态和信号转导功能，能够

对响亮甚至中等程度的声音作出反应。3.2单碱基编辑与植物育种为植物基因组功能解析及实现作物精准育种，

2020年，Tang等[33]在水稻和小麦上建立并优化了适用

于植物的引导编辑系统（plant prime editing,PPE)，并在

水稻和小麦基因组中实现精确的碱基替换、增添或删

除，效率最高可达21.8%。该系统可以实现所有类型

的碱基置换，以及碱基增加和删除。PPE系统极大地

扩展了单碱基编辑系统在植物基因组编辑中的应用范

畴。2017年，2〇叩等％用CBE单碱基编辑技术，选用

CaS9n融合了尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂，构建了密

码子优化的CBE碱基编辑系统,将三大重要农作物小

麦，水稻和玉米进行单碱基编辑育种，获得了性状改良

的植株，单碱基编辑效率最高可达到43.48%。3.3单碱基编辑与动物模型单碱基编辑系统在动物模型开发中的应用利于深

入研究疾病发生和发展的机制。2017年，Kim等[35]和

Liang等[36]将BE3碱基编辑系统应用于小鼠疾病模型

制备中，高效制备了单碱基突变的小鼠疾病模型。为了加速生物医药相关的大动物猪模型培育和农

业精准育种，2019年，Xie等[37]利用单碱基编辑器首次

在猪上实现多位点单碱基编辑。该研究首次从细胞、

胚胎及动物三个层面探讨了单碱基编辑器对猪多基因

进行同时点突变的可行性，并且通过体细胞核移植和

胚胎注射两种途径获得两种单位点单碱基突变猪模型

(杜氏肌营养不良症和早衰症猪模型）和一种三位点单

碱基突变猪模型（重症免疫缺陷猪模型）。3.4单碱基编辑与干细胞2017年，Yang等[38]利用单碱基基因编辑对人类基

因组遗传密码中的单个碱基进行了置换，在实验室中

获得了遗传效应增强的“超级”干细胞。这种“超级”干

细胞能够对细胞衰老和致瘤性转化产生双重抵抗作4展望基于CRISPR/CaS9系统的单碱基编辑器使基因组

编辑技术进人精确编辑的新时代，并已在人细胞、动物

和植物中进行高效的单碱基编辑。但单碱基编辑器也

有潜在的安全问题，最突出的就是脱靶效应。目前，在

动植物个体水平均发现单碱基编辑器有大量的脱靶效

应，同时，针对RNA的单碱基编辑器也发现有脱靶现

象发生。这说明单碱基编辑器的脱靶效应需要经过改

良后才能进一步应用于基础研究和临床，也为单碱基

编辑技术改良指明了方向。通过优化单碱基编辑的关

键酶，单碱基编辑技术巳体现出更少的拖把效率和更

精准的编辑效率。未来单基因编辑技术经过不断的优

化与改造，必将在人疾病研究、人类疾病相关动物模型

制备、动物和植物育种等方面得到广泛应用。参考文献[1 ] Jansen H, Gaastral W, Embden V, et al. Identification of genes

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Abstract

Base editing is a precise genome editing technique based on the CRISPR/Cas system. Base

editing use cytosine deaminases or adenine deaminases to perform base editing, and achieve base substitutions,

respectively. Base editor, engineered by fusing the Cas9 nikase (Cas9n) with a cytidine deaminase enzyme is

guided by a sgRNA to the target site. The position is the single base 4-7 of the target distance from the end of the

sgRNA site motif (protospacer adjacent motif, PAM) sequence for editing. Without cutting doublestrand DNAs,

base editor can precisely mediate the direct conversion of cytidine to thymineor or guanine to adenine. Therefore

the base editing history, composition, working principle, and technology developments were briefly words

deaminaseCRISPR/Cas9 Gene editing Single base editing Cytosine Deaminase Adenosine