质粒提取与分析 Protocol

质粒提取与分析是分子生物学实验中的基本技术之一，它是从细菌中提取和纯化质粒DNA，并对质粒DNA进行相关的分析和检测。下面是质粒提取与分析的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、实验原理

质粒是一种独立于细菌染体之外的DNA分子，它不参与细胞的染体复制，而是在细胞分裂时进行自我复制。质粒提取的原理是通过物理和化学方法裂解细菌，释放出质粒DNA，然后通过离心、沉淀和洗涤等步骤将质粒DNA与细菌其他成分分离，最终得到纯化的质粒DNA。

二、所需试剂和耗材

1. 试剂：

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溶液Ⅰ：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA（pH=8.0）、50mmol/L葡萄糖。

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溶液Ⅱ：0.1mol/L NaOH、1% SDS。

溶液Ⅲ：3mol/L醋酸钾、20mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）。

70%乙醇。

TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA（pH=8.0）。

2. 耗材：

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移液器。

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离心管和离心管盖。

1.5ml微量移液器。

无菌水。

0.22μm滤膜。

培养板和涂布器。

细菌培养液（如LB液体培养基）。

氯仿。

异戊醇。

三、实验仪器

1. 实验室搅拌器。

2. 高速冷冻离心机。

3. 水浴锅。

4. 无菌工作台或超净工作台。

5. 紫外线分光光度计。

6. 电泳仪和电泳槽。

7. 显微镜。

8. 恒温摇床或振荡器。

9. 烘箱或微波炉。

10. 量筒和烧杯。

11. 计时器。

12. 手套和实验服。

四、准备工作

1. 阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。

2. 准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

3. 检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

4. 用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

5. 用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。

6. 设置离心机的高速和低速离心参数，以及水浴锅的温度等参数。

7. 用紫外线分光光度计校准标准品（例如dsDNA）的OD值，以便在后续的DNA浓度测量中进行定量分析。

8. 将细菌培养液及其培养皿放入恒温摇床或振荡器中进行培养。

9. 在实验前要进行必要的个人防护措施，如穿着实验服、戴手套等，确保实验过程的安全性。

五、实验方法

（一）菌液培养

1. 在固体培养基上挑取单菌落，接种到液体培养基中，于37℃振荡培养10-16小时。

（二）质粒提取

1. 收集菌体：将培养液离心，弃去上清液，收集菌体。

2. 菌体裂解：加入溶液Ⅰ（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，50mmol/L葡萄糖），悬浮菌体，再加入溶液Ⅱ（0.1mol/L NaOH，1% SDS），裂解细菌，释放出质粒DNA。

3. 沉淀DNA：加入溶液Ⅲ（3mol/L醋酸钾，20mmol/L Tris-HCl，pH=8.0），沉淀质粒DNA。

4. 洗涤DNA：用70%乙醇洗涤DNA沉淀，再用无水乙醇干燥DNA。

5. 溶解DNA：将质粒DNA溶解于适量的TE缓冲液中（10mmol/L

Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH=8.0）。

（三）质粒纯化

1. 将粗提的质粒DNA溶液通过酚/氯仿抽提，去除蛋白质等杂质。

2. 氯仿抽提，去除酚类杂质。

3. 氯仿抽提后，加入无水乙醇沉淀DNA。

4. 用70%乙醇洗涤DNA沉淀，再用无水乙醇干燥DNA。

5. 将纯化的质粒DNA溶解于适量的TE缓冲液中。

六、注意事项

1. 在实验过程中要避免污染，所有的实验器具都应处于无菌状态，避免试剂之间的交叉污染。

2. 在使用高速离心机时要注意速度和时间控制，避免对样品造成破坏。

3. 在进行电泳检测时要选用合适的缓冲液和凝胶浓度，确保DNA样品能够正常迁移并显示出清晰的条带。同时要注意电泳时间不宜过长，以免影响检测效果。

4. 在存储质粒DNA时要注意温度控制，避免样品质量受到影响。同时要定期检查样品的保存情况并进行必要的处理。

5. 在进行实验时要注意安全问题，避免高温、高压等危险操作所带来的伤害。同时要佩戴适当的个人防护用品，如手套、口罩等，确保实验过程的安全性。

6. 在实验结束后要注意废弃物的处理，避免对环境造成污染。

七、常见问题及解决方法

1. 菌体裂解不完全：可能是由于菌体浓度过高或裂解时间不足导致的。解决方法是调整菌体浓度和延长裂解时间，以确保菌体充分裂解。

2. 质粒提取量低：可能是由于菌体裂解不完全或质粒结合不完全导致的。解决方法是优化菌体裂解条件和选择适当的吸附剂，以确保质粒充分释放并被吸附。

3. 质粒纯度不够：可能是由于未能有效去除蛋白质等杂质导致的。解决方法是优化抽提条件或选用其他纯化方法，以确保去除杂质并提高质粒纯度。

4. 电泳检测结果不清晰：可能是由于DNA样品质量差或凝胶浓度不合适导致的。解决方法是优化DNA提取和纯化条件，选择适当的凝胶浓度进行电泳检测，以确保条带清晰可辨。