Protocol蛋白质纯化步骤

Protocol

蛋白质纯化方法（镍柱）

柱前操作

诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min;

2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质；

3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体；

4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？

5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；

6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；

平衡柱子（柱体积：V）

7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）；

8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？

9. 3V BB;

柱层析

10.上样；

11. 10V Washing Buffer（WB）；

12. 6V Elute Buffer（EB);

13.分管收集，每管1~2ml.

各种缓冲液配方

1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9

1000ml

NaCl: 58.44×4=233.76g

Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g

Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g

2. 8×CB: 400mM NiSO4

1000ml

NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g

3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9

1000ml

NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g

4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9

1000ml

NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g

5. 6M 尿素

1000ml

尿素：60.06×6=360.36g

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Ni柱纯化蛋白注意事项

(2011-10-13 16:01:39)

使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。我们对整个操作的流程及注意事项，很可能是师从兄师那里获得的。这些经验都是大家智慧的结晶。同时，这也有一定的不足之处，那就是我们学习到的是局部，还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿，那些知识我们应该从哪里掌握呢？

给大家推荐一个办法，那就是参考那些大公司的实验手册。一般像GE、Qiagen等知名公司，都有Ni柱柱材料的产品，因此关于柱材料的各种性质参数，以及使用方法和注意事项都有详细的说明。

下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips，仅供参考。

1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等；

2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；

3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；

4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；

5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；

6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）

7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；

8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；

9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）

10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；？？？

Ni柱纯化His-tag蛋白质

一 非变性条件下抽提His-Tag蛋白质

下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（His Tag Protein） 的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（Native

Protein）。其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。

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1.样品准备

1) 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。

2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol）和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。该步骤冰上操作。

3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度位0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。

4)加入10% Triton X-100, 使Triton的终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟，间或混匀）；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度。

5)加入1M MgCl2，使MgCl2的终浓度为1mM，混匀。加入DNase, 使DNase的终浓度为10mg/ml，混匀，室温放置10分钟。？？

6)5000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20度保存。

2．层析

1) 将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0

Buffer洗。

2)将样品（步骤2（6））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时

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左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。

3)层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。

4)分别用5倍NTA体积的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。

5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用BBST的Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。

6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。

附溶液配方：

NTA-0 Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,

NTA-20 Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 20mM Imidazole(咪唑)

NTA-40 Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 40mM Imidazole(咪唑)

NTA-60Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 60mM Imidazole(咪

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唑)

NTA-80Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 80mM Imidazole(咪唑)

NTA-100Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 100mM

Imidazole(咪唑)

NTA-200Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 200mM

Imidazole(咪唑)

NTA-1000 Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 1000mM Imidazole

(咪唑)

二变性条件下从包涵体中纯化His-Tag的蛋白质

有些蛋白质细菌或其他细胞中表达效率很高，但溶解性很差，通常形成包涵体。这些蛋白质的溶解通常需要用盐酸胍或尿素。与MBP和GST的亲和层析材料相比，NTA树脂可以在6M的盐酸胍存在的情况下与具有His Tag的蛋白质结合。整个层析过程都是在有盐酸胍的条件下进行。纯化后的蛋白质需要进行复性，正确复性的蛋白质才具有生物学活性。

下列方法（步骤4-5）用于从细菌中抽提含His-Tag位于包涵体变性蛋白质。

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1．样品准备

1)准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。

2)加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol, 6M Guanidium HCl ）和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。

3)将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。

4)室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。

5)15000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20度保存。

2． 层析

1)将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的GuNTA-0

Buffer洗。

2) 将样品（步骤2（5））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。

3)层析用5倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。

4)分别用5倍NTA体积GuNTA-20，GuNTA-40，GuNTA-60，GuNTA-100，GuNTA-500洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。

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5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用BBST的Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。

6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。

7)纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则，根据蛋白质的特性来摸索具体的方案。

附溶液配方：

GuNTA-0 Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl

GuNTA-20 Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl,

20mM Imidazole

GuNTA-40 Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl,

40mM Imidazole

GuNTA-60Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl,

60mM Imidazole

GuNTA-100Buffer:

20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl,

100mM Imidazole

GuNTA-500 Buffer:

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20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl,

500mM Imidazole

附：NTA树脂的再生

NTA树脂在使用若干次数（3-5次）后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。注意：NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出NTA的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里，在等上一再生溶液流干后，再加下一再生溶解。用户需要自行准备25%,50%,75%，100%（v/v）乙醇和去离子水。

NTA再生步骤：

（1）从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的0.2M

Acetic Acid/6M guanidine HCl

洗。

（2）用2倍体积的去离子水洗。

（3）用3倍体积的2% SDS洗。

（4）用1倍体积的25%乙醇洗。

（5）用1倍体积的50%乙醇洗。

（6）用1倍体积的75%乙醇洗。

（7）用5倍体积的100%乙醇洗。

（8）用1倍体积的75%乙醇洗。

（9）用1倍体积的50%乙醇洗。

（10）用1倍体积的25%乙醇洗。

（11）用1倍体积的去离子水洗。

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（12）用5倍体积的0.1M EDTA pH8.0

洗。

（13）用3倍体积的去离子水洗。

（14）如果立即使用，用5倍体积的100mM NiSO4.6H2O洗，再用10倍体积的平衡溶液（NTA-0 Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗。

（15）如果想长期储存，加入1倍体积的20%乙醇，4度保存，使用前需要执行步骤14。

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