神经元的高尔基染法(protocol)

神经元的高尔基染方法（protocol）

针对神经元的Golgi-Cox染方案和处理

制作人：Tracey Wheeler（George Mason Univesity）

1. 配置高尔基溶液（1L容量）

A溶液：5%重铬酸钾溶液——重铬酸钾5g+蒸馏水200ml（最好在通风的情况下，用玻璃棒在烧杯中搅拌均匀）。

B溶液：5%——10g+蒸馏水200ml（最好在通风的条件下，用玻璃棒在烧杯中不断搅拌，适合加热直至溶解。

C溶液：5%铬酸钾溶液——铬酸钾8g+蒸馏水160ml（最好在通风情况下，用玻璃棒在烧杯中搅拌均匀）。

将A溶液和B溶液倒入500ml烧杯中搅拌均匀，C溶液倒入1000ml烧杯中，用400ml蒸馏水稀释，在不断搅拌中缓慢将A、B混合溶液倒入C溶液中，保存在带有棉花塞子的玻璃瓶中熟化5天（黑暗中）。

备注：根据下面的比率以及需要配置溶液的量加以配置

5体积的5%重铬酸钾

5体积的5%

4体积的5%铬酸钾

10体积的蒸馏水加入C溶液中

2. 将高尔基同业转入小玻璃瓶中

用塑料吸管从大玻璃瓶中吸取高尔基溶液（尽量避免吸入红沉淀物）放入小玻璃瓶中，大约为整瓶体积的3/4（剩下的容积足够容纳一只动物大脑）。

3. 用盐水注射技术处死动物

动物麻醉后，绑在空饲养盒子上（可以让血流入盒子中），打开胸腔暴露心脏，将0.9%

盐水60ml注入右侧心室底部（即动物的左心室），剪开左侧，心室底部（即动物的右心室），缓慢注入盐水，直至左侧的心室的血液全部消除（可能需要注射三次），断头取脑，放入配置好的高尔基溶液中，在黑暗中储存14天，2天后更换新鲜高尔基溶液。

4. 将脑组织转入蔗糖溶液中

蔗糖溶液：300g蔗糖+1000ml蒸馏水（用玻璃棒在烧杯中不断搅拌，适当加热直至溶解），然后放入冰箱中冷藏（一旦变冷即可使用）

倒掉高尔基溶液，将脑组织在滤纸上轻轻吸干，用蒸馏水冲洗广口瓶，放入3/4蔗糖溶液（有足够空间容纳脑组织），然后将脑组织放入广口瓶中（脑组织会漂浮起来），放入冰箱储存。脑组织一旦下沉，就可以准备切片。

5. 使用振动切片机切片

将刀片在二甲苯中浸泡5min去除油脂后（在通风条件下），取出擦干。配制6%的蔗糖溶液（蔗糖6g+100ml蒸馏水），在室温和低于室温下保存。将6%蔗糖溶液倒入振动切

片机的储存室直至刀片被覆盖。将脑组织（直到整个大脑的1/2）用强力胶固定在振动切片机的平台上（需要5~7min或更长时间，以确保组织在切片上被粘牢）。然后将粘有脑组织的平台插入储存室。将切片机的速度和幅度均调至中点（可根据不同的仪器和安全要求进行操作），在200μm或需要的厚度处切片（超过400μm的切片分析有困难）。用小画笔将切片移动到明胶化的玻璃片上。用石蜡膜覆盖组织。玻片比较平的一面用吸水海绵覆盖，石蜡膜一侧也用吸水海绵覆盖，用手掌轻轻压，尽量不要移动位置（目的是将组织切片压在玻片的明胶上，在染过程中能够粘附在玻片上），取掉海绵纸将玻片在湿润的环境中。

6. 染

配置新鲜的溶液（足够覆盖所有玻片）

蒸馏水（3体积）

氨水（1体积，在通风环境下）

柯达固定液（1体积，在通风条件下，黑暗中）

50%乙醇（1体积）

70%乙醇（1体积）

95%乙醇（1体积）

100%乙醇（3体积）

CXA溶液（1体积）

柯达固定液：将所有成分放在烧杯中，按顺序混合（避光）

加1010ml蒸馏水，加251ml柯达固定液A，加28ml柯达固定液B，加2020ml蒸馏水。（可根据需要每次配1/2或1/3）

CXA溶液：1000ml氯仿+1000ml二甲苯+1000ml乙醇（可根据需要每次配1/2或1/3，必要的话揭掉玻片上的石蜡膜，将玻片放入玻璃托盘通过以下环节染

⑴用蒸馏水冲洗1min

⑵氢氧化铵溶液中浸泡30min（黑暗中）

⑶用蒸馏水冲洗1min

⑷柯达固定液浸泡30min（黑暗中）

⑸用蒸馏水冲洗1min（只要在水中就可以开灯）

⑹用50%乙醇脱水1min

⑺用70%乙醇脱水1min

⑻用95%乙醇脱水1min

⑼用100%乙醇脱水5min

⑽用100%乙醇脱水5min

⑾用100%乙醇脱水5min

⑿在CXA溶液中放置15min(在通风条件下，玻片保存在CXA溶液中，当盖片时，依次取出玻片)

备注：经常换手套，在CXA溶液中手套易破裂

7. 用中性树胶盖玻片，然后晾干

如果可能所有的玻片都应该在通风环境下盖片，玻片应该在通风情况下平放保存24h，

依次从CXA溶液中取出玻片，用玻璃滴管在组织上滴两滴中性树胶（切片很快就变干，不要提前从CXA溶液中取出玻片，在空气中的时间不要超过20秒）。将盖玻片在切片上，尽量避免产生气泡。

备注：中性树胶太少组织会变干，太多会使盖玻片滑动。

将玻片放在吸水纸上（通常在鼠笼中使用白的托盘衬垫），让玻片平放24h，然后玻片

放在盒中保存（盒一定要打开）6个月才能进行分析。