Western-Blot 操作流程
(一) 组织中总蛋白的提取
用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中,加入200uLRIPA裂解液(含PMSF,比例为97:1:1:1),用杵子研磨3-4min,直至组织完全溶于裂解液(注意:杵子下2/3段事先在酒精里浸泡至少30min,用之前用滤纸吸干酒精,),以上过程均在冰上操作。研磨好组织后均在振荡机上振荡20-30s,每隔5min再次振荡,重复3次。然后在 4℃下12000rpm 离心 5min,取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80℃冰箱保存。
(二)BCA法蛋白含量的测定
(1) 从-20℃取出 1mg/ml BSA,室温融化后,备用。
(2)取96孔板,按以下表格分别加入相关试剂:
PBS(uL)+BSA(uL) 40+0 38+2 36+4 32+8 24+16 16+24 8+32 0+40
PBS(uL)+样本(uL) 39+1 39+1 39+1 39+1 39+1 39+1 39+1 39+1 ……
注意:加不同的样本时注意更换头
(3)以上步骤完成后,在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂(按试剂A:试剂B=50:1的比例配置),然后置于37℃水浴锅30min后取出。
(4)酶标仪测定OD值。
(5)EXCEL表格制作标准曲线,按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。
(三) 稀释蛋白及蛋白变性
如果计算出的样本的蛋白浓度偏高,需要用RIPA裂解液将蛋白稀释(一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL);稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中,加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液,置于99-100℃的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。(注意:将EP管的盖子盖紧,插入加热器的大圆孔中)煮过的蛋白置于-20℃冰箱保存。
(四) 制作SDS电泳胶
⑴
清洗玻璃板,双蒸水冲洗晾干后,根据厂家说明安装玻璃板。
⑵
配置10%的分离胶
配方:H2O2 4.0ml
30%丙烯酰胺液 3.3ml
1.5mol/l Tris ( PH8.8) 2.5ml
10%SDS 100ul
10%过硫酸胺 100ul
TEMED 4ul
⑶ 分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀(防止未灌胶就 发生凝固),将混合液立即加入玻璃板内,距梳子下缘约 lcm 处即可,蒸馏水封顶,待凝胶完全聚合(约30min)后,倒去双蒸水。
⑷ 制备5%的浓缩胶
配方;H2O2 3.4ml
30%丙烯酰胺液 0.83ml
1.5mol/l Tris ( PH6.8) 0.63ml
10%SDS 50ul
10%过硫酸胺 50ul
TEMED 5ul
(5)将所剩余空间加满浓缩胶,迅速将梳子插入浓缩胶中,室温放置约10min,待浓缩胶凝固后,轻轻将梳子拔出。(梳子也可在电泳液中拔出)
(五) SDS-PAGE 电泳
(1)按厂家说明组装好电泳槽,在电泳槽中加满电泳液后开始上样(上样上样);将准备好的蛋白样品和预染的蛋白质分子量标准品分别上样,注意切勿将样品溢出孔外。
(注意:样品的准备:每孔配制含 50μg 总蛋白的样品,按照组织中目的蛋白含量的多少调整上样量)
(2)接通电源开始电泳;80V 恒定电压下电泳30min,然后改为140V 恒定电压电泳1 小时;待溴酚蓝条带至凝胶底端时停止电泳。
(六) 转膜
(1)小心的从玻璃板上取下凝胶,切除所有浓缩胶及最下端的溴酚蓝条带(注意动作轻柔,保证凝胶的完整性)。将凝胶转移至转膜液中浸泡约 15min;同样,滤纸在转膜液中浸泡至少30s;准备好的硝酸纤维素膜( NC 膜)浸入转膜液中 15min。
(2)制备夹层“三明治”: 按照下列顺序排列:海绵垫→滤纸→凝胶→NC 膜→滤纸→海绵垫,注意要 逐层排放,每层需要排空气泡,以免影响转膜效率。
(3)将已经做好的“三明治”夹子放入转移槽中,使黑面对准电泳槽的黑面; 由于转膜时会产生大量热量,在电泳槽周围需要放置冰壶用以降温。将转移装置置于冰中,打开电源,调节电压至 100v,转膜时间 90min。
(七) 显和剪膜
转完后将膜用 1×丽春红染液染至可以看到蛋白条带,将膜放入TBST液体中,对照蛋白maker条带用直尺标出目的蛋白的范围并剪下,将丽春红染液洗净,膜晾干备用。
(八) 膜的免疫反应
(1)封闭:将晾干的膜移至含有封闭液(5%脱脂奶粉)的平皿中,室温下脱摇床封闭1-2小时。
(2)倒掉封闭液,附上一抗,用保鲜膜裹在平皿上,置于4℃冰箱过夜。
(3)第二天将平皿置于摇床上摇15-30min,将一抗回收,TBST液洗膜3 次,每次 5min;随后加入 HRP 标记的二抗,室温摇床上孵育1 小时;紧接着回收二抗,用TBST 洗膜 3
次,第一次10min,随后两次各5min。
(九) 化学发光、显影、定影
(1)准备工作:将化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液(注意避光)。
(2)将洗涤好的 NC 膜置于反应液中室温孵育 1-3min(避光)。
(3)去除过量的溶液,将膜夹在两层保鲜膜之间,X 胶片曝光,根据荧光强度决定曝光时间(过程中注意避光)。
Western Blot 整个操作流程中所用试剂生产厂家及编号
RIPA裂解液(中) Beyotime P0013C
Phosphatase Inhibitor Cooktall KANGCHEN KC-440.2
BSA蛋白标准品(5mg/ml) Beyotime P0012-3
BCA蛋白浓度测定试剂盒(A、B两盒) Beyotime P0012
蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE)(5* 15ml) Beyotime P0015L
30%丙烯酰胺液(100ml) Beyotime ST003
1MTris-Hcl(100ml)Ph8.8 Beyotime ST788
1MTris-Hcl(100ml)Ph6.8 Beyotime ST768
10%SDS(100ml) Beyotime ST628
TEMED Beyotime ST728
APS粉末(Ammonium Persulfate) 生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon
Biotech) A100486—0025
Tris碱(500g) Sangon Biotech A100826—0500
Glycine(500g) Sangon Biotech A100167—0500
SDS粉剂 Sangon Biotech A100227—0100
20*TBS Concentrate(500ml) Sangon Biotech B548105-0500
Tween-20 Sangon Biotech A100777—0500
蛋白质分子量标准品250ml(Prestained Piotein Ladder) Thermo Scentific
26616
丽春红染液(120ml) Beyotime P0022
BeyoECL Plus(共100ml) Beyotime P0018
超敏发光液(100ml) Thermo 34095
本文发布于:2024-09-22 04:09:56,感谢您对本站的认可!
本文链接:https://www.17tex.com/fanyi/26798.html
版权声明:本站内容均来自互联网,仅供演示用,请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系,我们将在24小时内删除。
留言与评论(共有 0 条评论) |