来自角蛋白降解菌Stenotro

东华大学硕士学位论文来自角蛋白降解菌Stenotrophomonas maltophilia DHHJ的角蛋白酶的酶解研究及分离纯化姓名：***申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：周美华;曹张军20071201

来自角蛋白降解茵ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＨＪ的角蛋白酶的酶解研究及分离纯化摘要角蛋白作为一种硬性蛋白，具有不溶于水和抗分解的性质，一般条件下不溶解，且不能被一般的蛋白酶水解，这给角蛋白的处理提出了难题。我国的角蛋白资源极其丰富，如家禽羽毛、角蹄和皮革下脚料等，它们大部分没有被充分利用，有的甚至造成环境污染。而近年来畜牧业及氨基酸工业的大力发展使得蛋白资源极其紧缺，因此，研究有效的处理方法使废弃的角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸，使之能直接得到应用或作为进一步提纯氨基酸的廉价易得的原料，从而变废为宅，既保护环境又资源利朋，还将具有十分显著的经济效益和社会效益。论文应用课题组分离得剑的角蛋白降解菌嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ（ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＨＪ），研究该菌的角蛋白酶（粗酶）的酶解谱，然后纯化粗酶，获得了一种纯的角蛋白酶。首先，我们选ＪＨ几种常见的角蛋白废弃物，通过测定粗酶水解底物时的酶活性，对角蛋白降解菌的酶解谱进行研究。结果显示，同属于Ｊ３角蛋白的鸡毛和鸽毛角蛋白，其降解的酶活性在其余各种角蛋白中最高，说明嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ产生的酶对含Ｂ角蛋白的角蛋白材料的降解效果较好。另外，此菌也可降解ａ角蛋白，包括硬质角蛋白（牛角，羊角，指甲，羊蹄角）和羊毛、头发、牛毛等软质角蛋白。由嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ所产角蛋白酶对各类角蛋白底物的降¨ｌ

解，说明此角蛋白酶的酶解范围相当广泛，具有开发应用价值。然后，课题研究了颜在羽毛酶解过程中产生的作用。选择同一养殖场鸡的三种不同颜的羽毛，使各颜的羽毛的长度和重量尽量相等，假定各种颜的羽毛样品对酶和菌株的降解作用表面是相同的，分别以完整羽毛和羽毛粉作为研究对象。对不同颜的羽毛的研究发现，只有当羽毛完整无破损时，颜才对羽毛降解产生影响，且颜越深降解效果越差，说明黑素对羽毛降解的影响可能只是增加其结构上的优势，一旦羽毛经过粉碎，结构上的优势被打破，黑素便无影响。这说明了在羽毛发酵前进行适当的处理是非常必要的，可以降低羽毛自身结构对降解产生的不利影响。再后，论文根据现有实验室的实验条件，选择硫酸铵盐析、凝胶层析和ＣＨＴ层析对角蛋白酶的粗酶进行了纯化。硫酸铵盐析时，在粗酶液中加入不同浓度的硫酸铵（ＷⅣ），综合考虑比酶活和产率，认为１０％的硫酸铵浓度得到的提纯结果是比较合适的，以此作为进一步提纯的起始步骤。在ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．１００凝胶层析时，以ｐＨ７．５、０．２Ｍ的磷酸钠缓冲液作为半衡液和沈脱液，确定最适合的一１￡衡和沈脱流速分别是０．５ｍＬ／ｍｉｎ和０．４ｍＬ／ｍｉｎ，上样量为０．５ｍＬ，收集管每管收集ｌｍＬ，收集３０管，样品就可以完全被沈脱下来。收集有酶活性的部分进行下一步的纯化。ＣＨＴ层析时，选用单梯度洗脱，其半衡液（Ａ液）：５ｍＭＰＢ，ｐＨ７．５；洗脱液（Ｂ液）：４００ｍＭＰＢ，ｐＨ７．５；Ａ液和Ｂ液中分别加入３０ｍＭＮａＣｌ以优化分离效果。平衡流速为０．５ｍＬ／ｍｉｎ，上样量为１．４ｍＬ，洗脱条件为：Ａ液洗脱２ｍｉｎ，Ｏ％。１００％Ｂ

液洗脱４ｍｉｎ，Ｂ液洗脱１９ｍｉｎ，流速ｌｍＬ／ｍｉｎ，每管收集ｌｍＬ，共收集２５管，即可将样品完全洗脱下来。经过多步纯化后，角蛋白的纯化倍数达到１７．２４。利用ＳＤＳ．ＰＡＧＥ验证角蛋白酶的纯化结果。浓缩胶５％、分离胶１２％为此角蛋白酶电泳的最佳条件。变性和非变性的电泳条件的结果说明，此角蛋白酶是一种单纯酶，分子量大约为３５．２ｋＤａ。关键词：羽毛废弃物，嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ，角蛋白酶，酶解性质，纯化

ＥＮＺＹＭＯＬＹＳＩＳＡＮＤＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＡＫＥＲＡＴＩＮＡＳＥＦＲＯＭＫＥＲＡＴＩＮ—ＤＥＧＲＡＤＩＮＧＢＡＣＴＥＲＩＵＭＳＴＥＮＯＴＲＯＰＨｏＭｏＮＡＳＭＡＬＴＯＰＨｌＬＩＡＤＨＨＪＡＢＳＴＲＡＣＴＡｓｅｎｃｒｕｓｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ，ｋｅｒａｔｉｎｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｎｏ‘ｄｉｓｓｏｌｖｅ，ｂｅｄｉｓｓｏｌｖｅｄｉｎｎｏｒｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ａｎｔｉ．ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉ－ｐａｉｎ，ａｎｄｉｔａｌｓｏｃａｎｎｏｔＳｏｋｅｒａｔｉｎｉｓｖｅｒｙｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｂｅｄｅｌｔｗｉｔｈ．Ａｎｄａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅｍａｔｅｒｉａｌｓ，ａｓｗａｓｔｅｓ，ａｒｅｒｅｌｅａｓｅｄｌｅａｔｈｅｒｈｅｅｌｓ，ａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｒｅｓｏｕｒｃｅＳＯａｌｏｔｏｆｋｅｒａｔｉｎｉｎＣｈｉｎａ，ｓｕｃｈｈａｖｅｎｏｔｂｅｅｎａｓｆｅａｔｈｅｒｓｆｒｏｍｐｏｕｌｔｒｙｆａｒｍｓ，ｏｎ，ｂｕｔｔｈｅｙｕｓｅｄｐｒｏｐｅｒｌｙ．Ｗｉｔｈｔｈｅｒａｐｉｄｓｔｏｃｋｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｔｈｅｄｅｍａｎｄｏｆｐｒｏｔｅｉｎｔｏｉｓｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．Ｓｏｉｔｉｓｖｅｒｙｎｅｃｅｓｓａｒｙｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓｔｏｍａｋｅｗａｓｔｅｆｅａｔｈｅｒｃｏｎｖｅｒｔｔｏｐｒｏｔｅｉｎｍｉｘｉｎｇａｍｉｎｏａｃｉｄａｎｄｔｏｍａｋｅｉｔｔｏｂｅｕｓｅｄｄｉｒｅｃｔｌｙｏｒｔｏｂｅｔｈｅｃｈｅａｐｒｅｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄ．Ｔｏｐｒｏｔｅｃｔｏｕｒｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄｍａｋｅｆｕｌｌｕｓｅｏｆｔｈｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｗｅｗｉｌｌｔｕｒｎｔｈｅｗａｓｔｅｓｔｏｔｒｅａｓｕｒｅｓｗｉｔｈｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋ，ａｎｏｖｅｌｋｅｒａｔｉｏｎｌｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＨＪ，ｗｈｉｃｈｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｒｅｓｅｒｖｅｄｉｎｏｕｒｆｒｏｍｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｆｏｒｔｈｅｒａｎｇｅｏｆｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｃｒｕｄｅｅｎｚｙｍｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｃｒｕｄｅｅｎｚｙｍｅｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｄｏｂｔａｉｎｅｄｅｎｚｙｍｅ．ａｍｏｎｏｍｅｒｉｃＦｉｒｓｔｌｙ，ｗｅｃｈｏｓｅｓｅｖｅｒａｌｃｏｍｍｏｎｋｅｒａｔｉｎｗａｓｔｅｓａｎｄｍｅａｓｕｒｅｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｎｔｈｏｓｅｋｅｒａｔｉｎｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｂｙｃｒｕｄｅｅｎｚｙｍｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｆｏｗｌａｎｄｐｉｇｅｏｎｆｅａｔｈｅｒｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏＢ－ｋｅｒａｔｉｎｓｗｅｒｅｍｏｒｅａｃｔｉｖｅｋｅｒａｔｉｎｆｏｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｏｔｈｅｒｓｏｕｒｃｅｓ．Ｂ－ｋｅｒａｔｉｎｍａｔｅｒｉａｌｓｈａｄｂｅｔｔｅｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｂｙｔｈｅｅｎｚｙｍｅｆｒｏｍＶｌ

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主要缩略词表Ⅺ

表格清单表１．１羽毛粉成分（％）……………………………………………………………４表１．２羽毛粉中养分含量（％）…………………………………………………４表１．３一些重要的细菌角蛋白酶：来源，生长条件和角蛋白水解………一８表３－１考马斯亮蓝法测定蛋白质………………………………………………２６表３．２水解不同颜的羽毛粉时的酶活性…………………………………２９表４．１硫酸铵溶液粗提结果………………………………………………，．．．…４４表４．２酶的纯化结果…………………………………………………………．４６表４．３标准蛋白质分子量……………………………………………………４７Ｘ

图形清单图１．１图１．２图１．３图１—４图１．５图２－１图２．２图３－１图３－２图３－３图３．４图４．１图４．２ａ一角蛋白的结构…………………………………………………………２角蛋白分子问的二硫键…………………………………………………２Ｂ．角蛋白（丝心蛋白）１３片层结构……………………………………３Ｓ．２２１变种分解角蛋白的生化示意图………………………………．１３角蛋白中硫的降解反应………………………………………………１３不同软质角蛋白作底物时的酶活性…………………………………．２１不同硬质角蛋白作底物时的酶活性…………………………………．２１完整羽毛的颜对酶活性的影ｎ向……………………………………２７菌株降解羽毛后蛋白质含量对比……………………………………２８羽毛粉的颜对酶活性的影响………………………………………．２８水解不同颜的羽毛粉时的酶活性…………………………………２９央心放置』｜ｉ页序…………………………………………………………４３ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．１００凝胶过滤１０％硫酸铵卡日提的蛋白质样品（Ｂｉｏ．Ｒａｄ层析系统数据图）………………………………………．．．…………４５图４．３图４．４图４．５ＣＨＴ层析凝胶过滤的蛋白质样品（Ｂｉｏ．Ｒａｄ层析系统数掘图）…４６ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳图谱…………………………………………………４７标准蛋白质的标准曲线………………………………………………４８ＩＸ

东华大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：弓岳毒２．ｏ曰≥叫年Ｉｚ月

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东华大学硕ｔ学位论文１绪论１绪论角蛋白（ｋｅｒａｔｉｎ）是一种蛋白质，主要存在于羽毛、指甲、皮肤表层等处，在自然界中非常丰富，我国拥有丰富的角蛋白资源，年产角蛋白上百万吨。在现代农业中，大规模的家禽养殖产生了大量的蛋白质废物，其中羽毛废弃物产量最多，年产量达７０多万吨。利用家禽羽毛作饲料的研究，美国、英国和前苏联相继进行了２０多年，闩本年产羽毛饲料５万多吨，美国１９６９年羽毛蛋白的使用量已达到１６万吨【１１。我国从二十世纪八十年代左右开始重视羽毛废物的资源化利用，但大都只是经过简单处理制成羽毛粉后直接出口，换汇率很低；其中约１０％．２０％主要用于制备动物饲料来加以利用，利用率和利用价值都不高，而另外大部分没有被充分利用，有的甚至造成局部的环境污染，其分泌物所含有的致病微生物也会对人类健康造成危害。随着工业进步、人民生活水平的提高、医疗保健的加强及畜牧业的发展，动物蛋自质资源的短缺逐渐明显，已慢慢成为我幽饲料工业发展的制约因素，国内氨基酸原料（蛋白质）的短缺越来越严重，因此，大力的研究开发动物蛋白质、氨基酸及其连锁产品非常有必要。处理角蛋白多数用物理（高温、高压）和化学（强碱、强酸）水解法印Ｊ，但是存在能耗高、破坏了一些氨基酸、三废不易处理、环境污染严重、经济效益不高等问题。为了更好地利用角蛋白资源并且保护环境，许多研究者试幽利用微生物来降解角蚩臼，并且取得了很大的成绩，现已有不少的报道。无论是羽毛的降解转化，还是病原菌侵染皮肤，角蛋白的降解都离不丌酶的作用，参与角蛋白的生物降解的酶就是角蛋白酶（ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ）。从５０年代起，科学家相继发现许多皮肤真菌或细菌能分泌具有角蛋白水解活性的角蛋白酶，该酶决定了病原菌侵染皮肤（包括附属器头发、指甲和粘膜等）的能力。研究表明，真菌侵染皮肤的过程足机械（菌丝侵入）、化学（还原·陀微环境）和生物冈素（角蛋自酶酶解）协同作用的结果。１９６３年Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎｌ８Ｉ等将具有分解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶，山真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中』一泛应用，具有嫩化肉类、生产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致疯牛病和人类克雅氏症的Ｐｒｉｏｎ蛋白（ＰｒＶＳｃ构象）的降解，更使其成为研究热点，具有巨大的应用和研究价值１９Ｊ。１．１角蛋白概述

东华大学硕上学位论文１绪论１．１．１角蛋白的结构和性质角蛋白材料是一类具有从纳米到厘米尺度上分级结构的天然生物复合材料，是脊椎动物的皮肤、毛发、角、羽毛和足的主要构成物质。角蛋白是不溶性的纤维状动物蛋白质，是外胚层细胞的结构蛋白１１０】。按物种可分为哺乳动物角蛋白、鸟角蛋白和爬虫类角蛋白，按成分和结构可分为ａ角蛋白和Ｂ角蛋白。从一级结构上看，ａ角蛋白含胱氨酸较多（５％），胱氨酸中的二硫键在肽链间形成交联结构阻碍蛋白的溶解【１０，１１】；从高级结构上看，ａ．螺旋构象的多肽链构成：三股右手ａ．螺旋向左缠绕，拧成一根称为原纤维的结构（ａａＮ合的超二级结构），直径为２ｎｍ；原纤维再排列成“９＋２”的电缆式结构，即微纤维，直径为８ｎｍ；成百根微纤维包埋在硫含量很高的无定形基质中，结合成一不规则的纤维束，称大纤维，其直径为２００ｎｍ（见图１．１和图１．２）。ａ角蛋白存在于哺乳动物中，如毛发、羊毛、指甲、蹄、角等结构蛋白中，具有很好的伸缩性能。图１－１ａ－角蛋白的结构Ｆｉｇｕｒｅ１－１Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａ－ｋｅｒａｔｉｎ图１－２角蛋白分子间的二硫键Ｆｉｇｕｒｅ１－２Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｋｅｒａｔｉｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２

东华人学硕士学位论文１绪论Ｂ角蛋白是反平行式Ｂ．折叠片以平行的方式堆积成的多层结构。在羽毛角蛋白中，两条彼此缠绕的螺旋状原纤维链构成徽纤维，原纤维链由８微晶组成（Ｂ微晶是头尾连接的一段Ｂ．构型的多肽），Ｂ微晶上带有不规则的股链排列在它的侧面。两条原纤维股链呈反平行排列【１２Ｊ。链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系，因此它的特性为抗张强度高，但不能拉伸。Ｂ．角蛋白富含甘氨酸，丙氨酸、丝氨酸和一些由酪氨酸、脯氨酸、颉氨酸组成的大侧链，主要存在于鸟类和爬虫动物，在自然界中以天然存在的蚕丝和蜘蛛丝中的丝心蛋白为代表【１３，１４１（见．图１．３）。图１－３ｆｆ．角蛋白（丝心蛋白）Ｂ片层结构Ｂ－ｋｅｒａｔｉｎ（ｆｉｂｒｏｉｎ）Ｆｉｇｕｒｅ１—３Ｂ－ｓｈｅｅｔｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ角蛋白具有不溶于水和抗分解的性质，这主要决定于如下的几个方面：胱氨酸残基所提供的分子间二硫键的高度交叉连接；氢键的作用以及分子问相互的疏水作用；其结构通过分子问二硫键、氢键、盐键和其他交键作用形成高度交联的三维稳定结构，在一般条件下／ｆ、＝溶解，只有当二硫键或肽键断裂以后，／４’会分解成短肽。二：硫键的断裂需要特殊ｐＨ或强烈的还原作川，而肽键的断裂需婴特异性很高的角蛋白酶，且不能被一般的蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）水解【１５１，给角蛋白的处理提出了难题。１．１．２角蛋白的应用据测定，羽毛角蛋白的粗蛋白含量约在８０％以上（见表１．１１１６１），含有丰富的赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、氨酸、组氨酸、甘氨酸、胱氨酸等１０多种动物所必需的氨基酸，迩含有常量元素、微量元素、维生素以及一些未知生长凶子。羽毛粉中也含有较高的能量和较多的Ｂ族维生素。表１－２１１７ｌ列举了羽毛粉中的养分含量（风干计）。因此羽毛角蛋白废弃物经过适当的处理具有十分广泛的用途，３

东华人学硕ｌ：学位论文１绪论表１－２羽毛粉中养分含量（％）Ｔａｂｌｅ１－２Ｎｕｔｒｉｏｎａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｆｅａｔｈｅｒｐｏｗｄｅｒ（％）含量２５２１‘５．１４５．５６１．１４１．２０１．８２８．９５５．９４４．７９０．５２２．２８１７．３７１．０成分干物质粗蛋白灰分苏氨酸笨丙氨酸精氨酸丝氦酸脯氨酸丙氨酸颉氨酸亮氮酸异亮氨酸核黄酸（ｇ／ｋｇ）泛酸（ｇ／ｋｇ）含量９０．７６８０．８５２．３４３．６２３．８８５．５２８．４７８．０１３．８２６．０３６．５９３．６８１．９８．１成分代谢能（ｋｃａｌ／ｋｇ）粗脂肪天ｌ、ｊ冬氮酸组氨酸羊毛硫氨酸赖氨酸谷氨酸甘氨酸胱氨酸蛋氨酸酪氨酸烟酸（ｇ／ｋｇ）谷氨酸（ｇ／ｋ９１１．１．２，１动物饲料【１６】或饲料添）Ｊｌｌ期Ｊ［１８Ｊ目自，ＪＩ困内外对羽毛粉蛋￡Ｊ臼ｄ料的产业化生产方法１１９ｌ主要有高压水解法、化学水解法、膨化处理法等，其中国内广泛使用的是高压蒸煮水解法，但制备所得的饲料营养价值不高，且存在耗能多、破坏部分氨基酸等问题。因此为吏好地利用羽毛角蛋白资源并保护环境，当静人们丌始关注采用生物技术来处理羽毛粉，提高羽毛粉的蛋白品质，从而节省家禽同粮中大豆、鱼粉的用量，促进家禽业的发展。１．１．２．２肥料由角蛋白废弃物生产的复合氨基酸螯合剂，可与畜禽生长所必需的微量金属４

东华大学硕士学位论文１绪论离子反应生成具有环状结构的配位化合物，从而能大大提高微量元素的生物利用率，另外其稳定常数适中，ｋ不受土壤ｐＨ值及其它离子的干扰，可被作物直接吸收。因此以废弃羽毛为原料水解获得复合氨基酸螯合剂并制取氨基酸微肥【删，不仅能大大提高作物对微量元素的吸收利用率，也可大大降低生产成本。此外，废弃羽毛还可以水解生产液体氨基酸复合微肥【２１１。１．１．２．３农药和医药角蛋白水解制得的氨基酸及其衍生物、金属络合物对农作物具有杀菌防病和刺激生长的双重效果ｆ２２１。因此将其作为杀菌剂、杀虫剂、除草剂和植物生长促进剂的功能，正受到人们越来越多的关注。复合氨基酸溶液可直接注入人体补充营养，替代部分人血浆，对肝病也有一定疗效１２３１。胱氨酸可防治脂肪变性、肝硬化以及其他肝病，也是膀胱炎、秃顶、脱发、神经病、中毒性病症的特效药。１．１．２．４皮革填充剂和复鞣剂利毛经适当的碱降解处理可获得一定分子量的蛋白质混合物，它可用作镉鞣鞋面革及服装革的填充材料，具有改善皮革的丰满性、弹性及染性能的特点【２训。此外，经乙烯基类单体接枝改性后即将羽毛角蛋白用作铬革的复鞣剂，具有优良的选择填充性，并对铬革染无影响【２５Ｊ。１．１．２．５食用浓缩调味液羽毛蛋白中含有丰富的谷氨酸、天冬氨酸等鲜味氨基唆。以角蛋白为原料水解提取胱氨酸后，剩余母液可生产营养丰富、味道鲜美的食用浓缩调味液ｆ２６１。这种方法不但充分利用了蛋白质资源，还消除了以角蛋白为原料生产胱氨酸后剩余母液的环境污染问题。１．１．２．６薄膜和包装材料对利毛进行深加：【．：后能制成叮食ＪＨ的薄膜和蒙Ｊ支包装材料【：７１，这类产品清晰、峰固、柔韧、无异味，还能制成香肠等产品。１．１．２．７化妆品和洗涤剂近年来研究发现利毛角蛋白是制作化妆品的优质材料。从加工处理后的羽毛角蛋白中可制得棕榈酰缩氨酸，进一步制成皮肤清洁剂、涂擦剂、口红和化妆品的湿润剂１２７１。１．２微生物降解角蛋白５

东华大学硕Ｉｊ学位论文１绪论１．２．１降解角蛋白的微生物的类早在十九世纪初期，人们就己发现有一些高等生物如衣蛾、兀鹰和苍鹰能降解角蛋白，而自１８９９年Ｗａｒｄ报道了真菌马爪甲团囊菌（Ｏｎｙｇｅｎａｅｑｕｉｎａ）能分解角蛋白以来，到目前为止已发现有３０多种微生物具有降解角蛋白的能力，即能分泌出降解角蛋白的酶，其中包括细菌、放线菌和真菌。下面简要介绍一下这方面的研究进展。１．２．１．１真菌在众多微生物中，最早发现能降解角蛋白的就是真菌。早在１８９９年Ｗａｒｄ就发现马爪甲团囊菌。１９２６年Ｎａｎｎｉｚｚｉ提出坏癣真菌可水解角蛋白。在许多能降解角蛋白的丝状真菌中最典型的是发藓菌属。１９８０年Ｊａｉｎ等【２８】研究发现马发藓菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｙｔｏｎｅｑｕｉｎｕｍ）和轮枝孢菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｔｅｎｕｉｐｅｓ）具有较高的羽毛降解能力。１９９５年Ｓｉｎｇｈ等【刃Ｊ从２１种真菌的研究中发现猴发藓菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｙｔｏｎｓｉｍｉ）降解羽毛角蛋白的能力最强。２０００年Ｔａｗｆｉｋ等【３０】从患有骨藓的病人皮肤中分离到发藓菌Ｔｒｉｃｈｏｐｙｔｏｎｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ。除发藓菌属外，１９９３年罗文等１３ｌＪ从土壤中分离到一株霉菌，初步鉴定为串孢属菌（Ｃａｔｅｎｕｌａｒｉａｓｐ．）。１９９６年Ｓａｎｔｏｓｌ３７Ｊ手艮道分离到一株烟曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）。２００１年中困科学院的曹军等１３３】也从土壤中分离到一株有效降解角蛋白的栖土曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｔｅｒｒｉｃｏｌａ），对其进行了ＵＶ射线的处理后研究了发酵条件的优化。Ｖｉｇｎａｒｄｅｔ等１３４，３５Ｊ分离到一株微孢长囊头孢霉菌（Ｄｏｒｏｔｏｍｙｃｅｓｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ），它能降解人体角质层，不产生毒素，还能降解指甲和蹄角。Ｔａｗｆｉｋ等１３６】也从污泥中分离到两种ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ和两种ｓａｐｒｏｐｈｙｔｅｓ，能降解人发、鸡毛和羊毛。Ｋａｕｌ［３７】等人也从一百种鸟类的羽毛上分离到１４种（分别属于１０个属）能够利用角蛋白的真菌（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ、Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ、Ｃｈａｅ幻ｍｉｕｍ、Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ等）。剑ＥＪ自，Ｊ．为止，发现具有降街犁角蛋白能力的真菌宵１８个属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ，Ａ５ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ，Ｔｒｉｃｈｕｒｕ，Ｕｒｖｕｌａｒｉａ。Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，ＧｅｏｍｙｃｅｓＧｌｅｏｍａｓｔｉ，Ｍｏｎｏｄｉｃｔｙｓ，Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ，Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ，Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ，Ｕｒｏｃｌａｄｉｕｍ，Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ，Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ，Ｄｏｒａｔｏｍｙｃｅｓ）。尽管种类很多，但ｍ于这些真菌大多属于皮肤真菌，存在致病性，而没有太多的经济价值１３８Ｊ。１．２。１．２放线菌许多放线菌也能降解角蛋白，但多为链霉菌属。１９５９年Ｎｏｖａｌ等【３９】首先发现弗氏链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｒａｄｉａｅ）能降解角蛋白，并对产生的角蛋白酶进行了详尽的研究，提出了角蛋白复合酶学说。１９９３年丁正民等…分离纯化到一株分解羽毛的放线菌ＳＳ．１，发酵５天就不见成形鸡毛。１９９４年涂国全等１４１’４２１分离６

东华大学硕十学位论文１绪论到具极强分解能力的Ｓ．２２１菌株，定名为弗氏链霉菌Ｓ．２２１变种（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｒａｄｉａｅｖａｒ．Ｓ．２２１Ｔｕ）。１９９５年ＢｒｉｇｉｔｔｅＢｏｃｋｌｅ等１４３Ｊ发现密旋链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐａｃｔｕｍ）可降解羽毛，并提纯到一种丝氨酸型蛋白酶。１９９９年Ｐｈｉｌｉｐｐｅ又分离到一株微白黄链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ离到一株嗜热的禾生链霉菌（ＴｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔＢｒｅｓｓｏｌｌｉｅｒ［４４１ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ）。２０００年Ｓｚａｂｏ掣４５Ｊ分Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｏｆａｃｉｅｎｔｓ），该菌在４０℃时可有效地降解角蛋白。其它还有热紫链霉菌ＳＤ８（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓＳＤ８）１４６。，拟若卡氏属（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓｓｐ．）１４７１，高温放线菌属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）［４８Ｊ和高温单孢菌（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ｖ４引。１．２．１．３细菌可降解羽毛角蛋白的细菌发现比较晚，１９９０年Ｗｉｌｌｉａｍｓ等【５０１从家禽养殖废物的高温厌氧消化系统中获得了能够降解羽毛的地衣芽孢杆菌（ＢａｃｃｉｌｔｕｓｌｉｎｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＰＤＷ－１），其降解羽毛角蛋白产物的可消化性和营养价值与饲用大豆蚩白相同，但该菌种只能降解高温蒸煮过的利毛，而从该消化系统中分离出的弧菌科细菌（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）在２天内’町使末蒸煮过的羽毛完全降解【５ｌＪ，包括羽小枝和羽轴。１９９３年Ａｔａｌｏ等１５’】分离到一株能降解不同纤维性蛋白的嗜热杆菌Ｐ．００１Ａ（ＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃＢａｃｉｌｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓＰ．００１Ａ）．１９９５年胡介卿等【５３Ｊ从鸬鹚肠道分离出的Ｆ５变异株枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）具极强的分解能力。１９９６年ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＩ“Ｊ分离到一株利用羽毛角蛋白的嗜热厌氧菌闪光杆菌（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓ）。２００１年Ｒｏｚｓ等１５５ｊ又从部分降解的习习毛中分离到一株能降解角蚩白的地衣芽孢杆菌，在温度为４７℃、ｐＨ为７．０的发酵条件下，该茼表现出极强的降解能力。同年姚淑敏等１５６Ｊ从长期堆积废羽毛的土壤中分离筛选出一株芽孢杆菌，其摇瓶发酵的最佳条件为：温度为４２℃、ｐＨ为７．５、转速１２５ｒ／ｍｉｎ，最高酶活性可达２５．２０Ｕ／ｍＬ。近年来对降解羽毛的地衣芽孢杆菌的研究还在不断深入［５７，５８】。２００２年Ｇｅｓｓｅｓｓｅ等又发现了两株细菌Ｎｅｓｔｅｒｎｋｏｎｉａｓｐ．和Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ可产碱性角蛋白酶１５９Ｉ。其它还有黄币胞茼（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ），嗜麦茅寡养菌（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）署Ｕ金黄杆菌（Ｃ矗，．”ｅＤ施ｃ陀一“删）ｌ∞∞１。一些重要的产角蛋白酶的细菌见表１＿３１６４１。１．２．２角蛋白酶的酶学性质角蛋白酶由不同微生物合成，其分子量范围为２８ｋＤａ＇－－－９０ｋＤａ，也有发现分子量２００ｋＤａ左右大小的和分子量低于２０ｋＤａ的角蛋白酶分子。不同的菌种所产生的角蛋白酶存在一定的差异，这表现在酶的分泌方式、反应最适温度、最适ｐＨ值、酶的结构、组成、稳定性等方面。７

东华大学硕ｌｊ学位论文１绪论表１．３一些重要的细菌角蛋白酶：来源，生长条件和角蛋白水解Ｔａｂｌｅ１－３Ｓｏｍｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｂａｃｔｅｒｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓ：ｓｏｕｒｃｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｓｉｓ微生物来源磊爵篙霉霜ｒ祧／ｍｉｎｐＨ（ｒ／ｍｉ，瓣月‘度（℃））底物最角白产时佳蛋酶生问ＢＰｎＷｃｉｔｌｕｓ朗Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓ［６６１Ｋｏｃｕｒｔａｒｏｓｅａ家禽养殖废物高温消化系统７．５５０１２０１０ｄ３０ｈ鸡羽毛温泉十壤６．３７０静置７５４８ｈ一鸡羽毛ＬＢＰ．３１６７，６８］７．５４０磐缝解５５％７２ｈ３６３６ｈｈ鸡羽毛冯例乇ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＫＳｌ［６９，７０］家禽废物５－９４０２００８４ｈ鸡羽毛ＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｉｓＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＦＫ２８ｔ７１】５—６４０３０３７１５０十壤７７．５管７２；：驾翥髦ｊｄ砀ｅｒｍＤ肌ｎｅｒｏｂａｃｔｅｒ『７，．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ６．８地热温泉’。…、…”７ｋ０７ｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓｓｐ．ｎｏｖ．１ｔｅｌ静置１８０ｄ内９６ｈ降解７０％１０４ｄ蛐髯一７２ｈＢａｃ。ｉ。ｌ。ｌｕＩｓＫ一５０８１７３．７４］ＰＯＡ—ｌｉ６０ｌ腐烂羽毛悯Ｌ们七７４５斗）鸡羽毛羽毛粉鸡羽毛角蛋白粉，鸡羽毛鸡羽毛鸩羽毛鸡羽毛Ｘａｎｔｈ伽伽矗ｓｍ口，卿ｈｉｌａ，Ｐｗｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ『７５】７训家禽废物办ｊ曷墩例７’２００地热温泉’。…”…“。、７ｓｌａｎｄｉｃｕｍ／ＡＷ．１Ｉ０７含有鹿毛静置，ｎ剁４８ｈ４８ｈＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．Ｄｌｔ６ｑＢａｃｉｌｌｕｓ的十壤碱性泷十，７１３０２．５ｄ４ｄｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｉｓ一３７４８—６０ｈＡＬ．８９，Ｎｅｓｔｅｒｎｏｋｉａｓｐ．ＡＬ．２０【７６Ｉ一ｋｒ６ｐ７】Ｂａｃｉｌｌ“５ｓｐ．ＦＫ４６１７８ＩＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ些毫禽８废物十壤堆肥业家禽废物土壤牛毛，皮。革废物，９７２５．３０。。。”３７１８０７２ｈ４８ｈ５ｄ２５０２５０５大内降解８５％２４ｈ７２ｈＲＧｌ［７９Ｉ３７３０７２ｈ３６ｈ鸡羽毛鸡羽毛鸡羽毛Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ，．６０，．Ｐ５ｃ已月ｓｋｒｌ０１８０１１８０Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ６６３３１８１】Ｂａｃｉｌｌｕ５ｓｕｂｔｉｌｉｓＳ１４［８２Ｊ一一一一一一牛毛８

东华人学颀十学位论文１绪论有些菌以产生胞内酶为主，有些则以分泌胞外酶为主，霉菌一般既分泌胞内酶又分泌胞外酶。目前主要集中在脆外酶的研究，对胞内酶研究很少。根据最适ｐＨ值的不同可将角蛋白酶分为酸性酶（最适ｐＨ＜７）和中性酶或碱性酶，而大部分角蛋白酶都是胞外碱性的丝氨酸蛋白酶，最适ｐＨ值多数大于７．５，有的甚至高达１０。各种角蛋白酶的最适温度差异也比较大，有常温型的（３０℃、３８℃），也有耐高温型［堑ｊ（８３，ｆ１４Ｊ（６０℃、７０℃、８０℃），但多数角蛋白酶的最适温度在４０，５０。Ｃ之Ｉ自］［５７，８６１。对于不同角蛋白酶可水解底物的范围差异也较大，有的相当广泛惮”，除角蛋白外，还包括多种多肽和其它蛋自质；有的则范圉很窄。多数角蛋白酶优先利用动物角蛋白，而对人类角蛋白（尤其是头发）利用率较低或者根本不利用，这可能是头发中半胱氨酸比较多，而这与形成高度交联二硫键的网络有关１８７。。又掘报道１８８Ｊ，某些物质可增强角蛋白酶的活性，如磷酸、毓基乙醇、亚硫酸钠和维生素Ｃ等，筑基乙醇有助于打破双硫键从而提高角蛋白酶的酶解能力坤ｊ‘，亚硫酸钠主要作用于双硫键，但也可作用于多肷酶【８５Ｉ。一些金属离子如Ｆｅ７＋和Ｆｅ３＋能提高酶活性１８９ｌ，Ｃａ“、Ｍ９２＋也能增强角蛋白酶的活性，Ｚｎ２＋对酶活性影响小，但也有研究发现Ｍ９２＋、Ｚｎ“和Ｃａ７＋是角蛋白酶的抑制剂。添加其他氮源（如葡萄糖）和碳源（如蛋白质）可导致角蛋白酶活性降低。苯（ＰＭＳＦ）可１００％抑制角蛋白酶的活性，铝离子、磷酸凇对角蛋白酶也有抑制作用。Ｂａｎ、Ｈ９２＋、Ａｇ＋、Ｎｉ２＋、ＥＤＴＡ、碘乙酰胺、葡萄糖、Ｎ．乙基马来酰胺等则能强烈抑制酶活·肚ｆ７７，８３，８５，８８，８９１。１．２．３角蛋白酶的分子生物学研究１．２．３．１角蛋白酶的基凼结构特点角蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，可以被ＰＭＳＦ完全抑制。它与枯草丰Ｔ菌蛋白酶有着很高的序列同源性。Ｆ１｝ｊ，Ｊ．已从不同微生物ｌｆｊ克隆了几个编码角蛋ＥＪ雎因，在亲缘灭系近的种内ｆｌ，Ｊ基【犬¨ｒ司源’｜，扣高，角蛋白酶罐凶系统发育也与’ＵｆＪ的水源闲种的亲源关系相符合。如同来自Ｂａｃｉｌｌｕｓ），禹的Ｂ．１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＡＹ８１７１４３）及口．ｍＤｉａｖｅｎｓｉｓ（ＡＹ６６５６１１）基冈同源性为９９．５％。而菌种亲缘关系远，酶特性差别大，基因同源性小，来自Ｂａｃｉｌｌｕｓ属的８，ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ的ｋｅｒＡ（￥７８１６０）与Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属的ｆｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓ来自的ｆｌｓ（ＡＹ０３５３１１）的同源性为３３％。地衣芽孢杆菌ＰＷＤ．１（ＡＴＣＣ５３７５７）产的角蛋白酶基因ｋｅｒＡ和地衣芽抱卡Ｉ：菌ＮＣＩＭＢ６８１６产的ＳｕｂｌｉｔｉｓｉｎＣａｒｌｓｂｅｒｇ的基因序列相似性为９７％【唰，这２种基冈的启动子、核糖体结合位点和转录终止子也相似。推测的氨基酸序列表明这２种蚩白酶只有３个氨基酸不同，角蛋白酶中为Ｓｅｒｌ０２、Ａｌａ‘２子和Ａｓｎ２¨，而Ｓｕｂｌｉｔｉｓｉｎ中为Ｔｈｒｌ０２、Ｐｒ０１２８和Ｓｅｒ２１１。Ｃａｄｓｂｅｒｇ９

东华人学硕ｌ二学位论文１绪论以地衣芽孢杆菌ＰＷＤ．１的角蛋白酶基因ｋｅｒＡ为例【９１】，它由１４５７ｂｐ核苷酸组成，编码包括静蛋白原、蛋白原、成熟蚩白、５’非编码区及３’非编码区。编码区共１１３７个核苷酸，共编码３７９个氨基酸。ｋｅｒＡ基因有２个潜在的启动子序列（．ＴＡＴＡＡＴ．）分别位１２３＂－－－１２８与１４１＂－－－－１４６。一个潜在的核糖体结合位点位于距５’转录起始点（ＡＴＧ）８个核苷酸处。潜在的转录终止密码子（ＴＡＡ）位于３’端的２２个核苷酸处。最初产生的多肽为前蛋白原，经信号肽酶剪切形成蛋自原，再进一步剪切成成熟蛋白，由２７４个氨基酸残基组成。该成熟的角蛋白酶具有保守的催化三联体活性位点，由触ｐ３２、Ｈｉｓ６３矛ＮＳｅｒ２２０组成。ｆｌｓｌ９２Ｊ，来自Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓ的角蛋白酶基因，由２１０３个核苷酸组成，在基因上游有ＳＤ一至序列及在基因下游有１３ｎｔ的反向重复区，编码６９９个氨基酸，信号肽由２１个氨基酸构成，肽原由１２８个氨基酸构成。之后又对该酶晶体结构进行了研究【９３】，这也是第一个解析的角蛋白酶结构，结果表明该酶结构其由催化区（ＣＤ），Ｂ．火层区（ＳＤ）及肽原区（ＰＤ）三部分构成。对分离Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍｃａｎｉｓ的胞外角蛋白酶相对分子质量分别为４８０００、３１０００、３４５００的多肽的Ｎ’端中１７个氨基酸钱基序列进行分析，结果表明这些角蛋白酶多肽中天门冬氨酸、甘氨酸和内氨酸的含量很高【删。１．２．３．２角蚩白酶的ＬＩ丁诱导性角蛋白酶是一种诱导酶，它们需要外界的角蛋白作为诱导子。用角蛋白为底物可刺激角蛋白酶的产生，角蛋白酶分泌持续的时间和分泌强度也受角蛋白底物的强烈影响１８４Ｉ。早在１９８７年，Ｗａｗｒｚｋｉｅｗｉｃａ等１９４Ｉ就发现，羽毛角蛋白可诱导Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｇａｌｌｉｎａｅ的胞内角蛋白酶的表达，而且，当羽毛角蛋白溶于二甲亚砜后再加入该菌的生长培养基时，可发现该菌生长加剧。又如链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．一１３８２分泌的角蛋自酶，若存培养基中不加诱导剂，则其酶量下降１／５．７１１９”。这螳结果提示底物商接诱导产酶的ｎＪ‘能性。１．２．３．３角蟹ｆ７Ｉ酶的异源表达日ｉ，Ｊ．已克隆的角蛋门酶挂冈，来Ｆ１Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏ，．所西ＰＷＤ一１的艇闪ｋｅｒＡ（ＧｅｎｂａｎｋＩＤ：￥７８１６０）是由北卜罗术纳州：也大学Ｌｉｎｘ等克隆１９１Ｊ，由于其高效降解羽毛活性而是现在研究的最为深入的角蛋白酶基冈之一。利用定向进化及分子改造方法提高酶活性是现代酶学研究的发展方向。Ｐｏｒｒｅｓ等１９ｂＪ将Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎ＠ｒｍｉｓＰＷＤ一１菌株编码角蛋白基因ｋｅｒＡｌ．２ｋｂ克隆进ｐＰｌＣＺａｌｐｈａＡ及ｐＧＡＰＺａｌｐｈａＡ载体上，并转入巴斯德毕赤酵母Ｘ３３中进行胞外表达，转化子ｐＰＩＣＺａＡ—ｋｅｒＡ在培养瓶中用甲醇诱导后２４ｈ分泌重组蛋白，诱导１４４ｈ后的最终产量是１２４ｍｇ／Ｌ（２８５Ｕ／ｍＬ）。重组的角蛋白酶是糖基化的，与天然地衣芽孢杆菌角蛋白酶的生化性质相似。可降解角蛋白、牛血清蛋白、胶原、大豆１０

东华大学硕卜学位论文１绪论蛋白等。Ｌｉｎ等１９７Ｊ把地衣芽孢杆菌ＰｗＤ．Ｉ（ＡＴＣＣ５３７５７）角蛋白酶ｋｅｒＡ的整个基因和它的自身启动子Ｐｋｅｒ、营养启动子Ｐ４３和Ｐｋｅｒ．Ｐ４３组合体分别克隆到载体ｐＵＢｌ８并转入蛋白酶缺陷型枯草杆菌ＤＢｌ０４中。所形成的转化体ＦＤＢ．３、ＦＤＢ一１０８、ＦＤＢ．２９均可在羽毛和ＬＢ培养基中表达有活性的角蛋白酶。与ｋｅｒＡ基因在原菌株中只在羽毛培养基中表达而不在ＬＢ培养基中表达不同，带有Ｐｋｅｒ．Ｐ４３启动子的转化体ＦＤＢ一２９在羽毛培养基中表达地衣芽孢杆菌ｋｅｒＡ基因并分泌出活性很高的角蛋白酶，其产量是原始菌株地衣芽孢杆菌ＰＷＤ．１的３－－一５倍。推测，位于其上游的与其取向相同的Ｐ４３启动子和营养启动子加强了ｋｅｒＡ基因的表达１９８ｌ。该研究给我们如下的启示：构建一个好的工程菌不但可以提高产酶量，而且可以使酶的分离更为简单。梁斌等【９９】把编码地衣芽孢杆菌Ｌ－２５的角蛋白酶基因ｋｅｒＢ克隆到载体ｐＵＢｌ８．Ｐ４３质粒上，转化到蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌ＤＢｌ０４ｖ丰Ｊ表达，转化予ＦＤ．８（ＤＢｌ０４／ｐＬＫ一１８）可在含１０ｍｇ／ｍＬ卡那霉素的荆毛培养基上生长，同时可以完全水解所有羽毛，表明转化子ＦＤ一８能分泌角蛋白酶。李江等【１００Ｊ从弗氏链霉菌中纯化得到了一种丝氨酸蛋白酶ＳＦＰ２。经蛋白测序，得到部分氨基酸序列，设计简并引物，ＰＣＲ）‘Ｉ“增得到部分基冈序列，通过构建基因文库，获得了包括信号肽序列在内的完整的基因ｓｆｐ２，开放阅读框全。Ｋ９２４ｂｐ，包括１１４ｂｐ的信号肽编码序列和８１０ｂｐ的酶原编码序列，其中成熟蛋白编码基因长５７６ｂｐ，编码１９１个氨基酸，理论分子量为１９．１１２ｋＤａ。他们同时将酶原编码基因和成熟蛋白编码基凶均在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌巾得到表达，酶原编码基因表达产物具有正常的生物学活性。Ｄｅｓｃａｍｐｓ等【１０１Ｊ在巴斯德毕赤酵母ＫＭ７１Ｈ中表达重组的角蛋白酶ｒ．ＳＵＢ３。重组的ＳＵＢ３具有和天然角蛋白酶相同的生化特性，其Ｎ端氨基酸序列与天然的一致，均为ＡＬｌ阿Ｑ，产量为１５０ｍｇ／ｍＬ。１．２．４角蛋白降解的生化机制１．２．４．１角蛋白降解生化机制的耻论羽毛等硬性角蛋白降解过程十分复杂，目前对角蛋白降解的生化机制研究主要有以下几种理论：物理压力理论、膜电位理论、无机变性理论、复合酶理论。（１）物理压力理论物理压力理论认为角蛋白水解最初的动力来源于丝菌体的压力，１９９２年Ｍａｌｖｉｙａｌｌ０２】观察到角蚩白的降解先于胞外角蛋白酶的分泌，他认为这种降解与菌丝体的生长偶联，随着真菌的菌丝体的生长和延长，对底物产生压强，菌丝体无需要识别角蛋白的连续结构（有电镜照片为证）【１０２１，便可不断的伸入羽毛中，而这

东华人学硕仁学位论文１绪论种机械的物理作用可能有助于肽键切割活性位点的暴露。在初始阶段的降解以后由机械降解和酶解共同作用。（２）膜电位理论膜电位理论【１０３】认为细胞外不溶性角蛋白的降解可能由细胞表面的膜结合氧还原体系来完成，或由分泌到培养基中的一可溶性还原组分来完成。膜电位是通过还原角蛋白的二硫键或者是通过产生可溶性还原剂作用于角蛋白表面，使得蛋白链更适合于蛋白酶裂解，而在蛋白质降解过程中起着重要的作用。（３）无机变性理论无机变性理论【１０４Ｊ贝０认为是由分泌到培养基中的亚硫酸盐使底物的二硫键断裂，从而硫解变性后角蛋白进一步被细胞外蛋白酶降解。现在，在很多微生物最初的发酵液中可以检测到含硫代半胱氨酸残基的多肽和含巯基多肽的积累，而且随着发酵时问的延长，发酵液中的筑基化合物及亚硫酸盐的含量不断降低，取而代之的是硫酸盐。依据这些实验数据可以推测，微生物绌腮通过某种特殊的代谢首先分泌哑硫酸盐，亚硫酸盐在中性和碱性条件下把肽氨酸切割为半胱氨酸和硫代半胱氨酸，半胱氨酸、亚硫酸盐继而氧化为硫解最终的产物硫酸盐。反应方程式如下：Ｃｙｓ…ＳＳＣｙｓ＋ＨＳ０３一一一——－Ｃｙｓ—ＳＨ＋Ｃｙｓ—ＳＳ０３。（４）复合酶理论复合酶理论认为角蛋白酶是一种复合酶，含有特异裂解二硫键的二硫键还原酶和能使多肽水解的多肽水解酶。二硫键还原酶首先作用于角蛋白分子中的二硫键，使角蛋白的高级结构解体后产生变性的角蛋白，然后变性角蛋白又在多肽水解酶的作用下逐渐水解成多肽、寡肽及游离氨基酸，最后出转氨基作用产生氨气和硫化物使角蛋白彻底水解。该理论早在１９５９年Ｎｏｖａｌ等Ｉ”ｌ首先发现能降解角蛋白的弗氏链霉菌时以及１９６３年Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎｌ８｝片｛来白弗氏链霉茼的角蛋白酶和胰蛋白酶对ｆ毛角蛋白底物进彳『水解对比实验时提｝｛：，ｆ订．都末作深入的研究。１９９８年涂圈全等ｌ哂。０７】则对分离筛选／ｊ｛：经过初步签定后的弗氏链霉菌Ｓ－２２１变科·进行了其分解角蛋白的生化机制的探｝寸，并提出ｒ以上的复合酶理论（其生化机制见图１—４１。１２

东华人学硕上学位论文１绪论Ｉ－－Ｃｙ－－Ｓｌ一兰壁堑盟一－Ｒ１｛ｙ心Ｒ２－－Ｃｙ－－Ｓ—型ｉ－多肽，Ｒ２－－Ｃｙ－－Ｓ◆巯基化合物氧化酶ｌ壁ｌ水寡肽Ｓ０４２‘●～●一●一Ｈ２Ｓ●一脱氢氧化酶◆Ｉ簦上ＮＨ３游离氨基酸图Ｉ＿４Ｓ．２２１变种分解角蛋白的生化示意图Ｆｉｇｕｒｅ１－４ＰｒｏｃｅｓｓｏｆＳ一２２１ｔｏｄｅｇｒａｄｅｋｅｒａｔｉｎＣ，——ＳＣ。——ＳＨｆＣｙ——Ｓ三堕堡堑墅竺，＋Ｃｙ——ＳＨＣＯＯＨＲ一占一ｓＨ—堂逐坚ＩｌＮＨ２Ｈ２Ｓ＋ＮＨ３＋ＲｃＨ２Ｃ。。ＨＨ：ｓ、上篁垡竺◆ＳＯ。２＂Ｒ－ＨＳＪ图１－５角蛋白中硫的降解反应Ｆｉｇｕｒｅ１－５Ｄｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｓｕｌｆｕｒｉｎｋｅｒａｔｉｎ角蛋白中硫主要转化成筑皋化合物，硫化氢（Ｈ２Ｓ）和硫酸盐３种含硫化合物形式存在于分解产物中。通过进一步探索３种含硫化合物的彤成过程表明１１０５铷７１，巯基化合物是由角蛋白酶中二硫键还原酶裂解角蛋白中的二硫键而形成的；硫化氢是由含巯基化合物或巯基氨基酸（半胱氨酸）在脱氢氧化酶作用下，脱氢、脱氨基而形硫化氢（Ｈ２Ｓ）；硫酸盐的形成分别是由ＨｚＳ或巯基化合物中的硫通过氧化１３

东华人学硕Ｊｊ学位论文１绪论酶逐步氧化的结果（见图１．５）。从以上的各种理论不难看出角蛋白被降解的过程复杂多样。而且在的微生物环境中可能有不同的降解机制，有可能使用其中的一种，也有可能几种并用，迄今仍没有系统完整的理论。１．２．４．２角蛋白的酶解机理微生物能够降解角蛋白的关键在于当其周围环境中出现角蛋白时就会合成角蛋白酶。通过大量对角蛋白降解菌的研究，目前普遍认为微生物降解角蛋白的机理主要可分为三个相关步骤：变性作用、水解作用和转氨基作用。变性作用：由于角蛋白的大量二硫键的存在保证了其立体化学结构的稳定性，使其具有抗化学试剂和水解酶的特性，所以只要使二硫键发生断裂，角蛋白就容易变性，从而不具备不溶于水和抗分解的性质。在上述提到的角蛋白降解的生化机制理论中，我们可了解到角蛋白的变性作用可能由不同理论中的降解机制所产生，可能是其中一种，也可能是其中几种协同作用。水解作用：角蛋白只有在变性后才能被水解。变性的角蛋白在多肽水解酶的作用下逐步水解成多肽、寡肽及游离氨基酸。转氨基作用：经过脱氨基作用最终产生氨气和硫化物。１．２．５角蛋白酶的应用研究现状及展望从微生物中纯化的角蛋白酶活性很强，可以水解多种难降解的纤维蛋白类，如胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白。因此角蛋白酶具有广泛的应用自，Ｊ．景。１．２．５．１在医药卫生上的应用人体细胞表面的角质层阻碍了透皮吸收药物的有效吸收。角质层的主要成分是角蛋白、胶原蛋白等，它们的化学结构非常稳定，普通的蛋白酶对它没有降解作用。研究表明，真菌侵染皮肤的过程是机械（菌丝侵入）、化学（还原性微环境）和生物因素（角蛋白嘛酶解）协同作刷的结果。皮肷真菌诒二底物的诱导．卜Ｊ产牛角蛋｝ｊ酶，角蛋门酶分解角蛋白成短肽或氨基酸，使真菌得以获得营养所需要的氮源和碳源，并在皮肤组织ｒｆｌ繁贿生长。根掘真菌侵染皮肽的原理，若在透皮剂中添加角蛋门酶，可将表层角质酶解，以增加药物的渗透力，提高疗效。研究发现角蛋白酶能改善皮肤外用药物在硬蛋白中的通透性，达到皮肤病如甲癣的目的。角蛋白酶不仅在研究皮肤真菌感染分子机制方面有重要价值，还有助于伤口去痴和上皮再，芏，在帮助活性因子透过皮肤屏障、祛除皮肤多余角质、化妆品深层护理等【８】方面都很关键。此外，石家兴１９ｌ发现角蛋白酶（从枯草芽孢杆菌中分离得到）可破坏朊病毒（与羽毛角蛋白同属Ｂ结构），使其丧失传染能力，引起了轰动该功能已由荷兰疯１４

东华人学硕上学位论文１绪论牛病专业检测机构证实。角蛋白酶的这一新功能将会成为避免因朊病毒感染而造成的巨大损失的一种新方法。１．２．５．２在饲料工业中的应用角蛋白酶可将羽毛、猪毛等废弃物转化为高营养的饲料蛋白。羽毛中蛋白质含量超过９０％，氨基酸含量在７０％以上，还含有常量元素、微量元素、维生素以及一些未知生长因子，是动物饲料中的优良蛋白源，但该类蛋白中存在大量的二硫键、氢键和疏水键，交联度大，不可溶，不能被常见蛋白酶所降解，因而它在动物体内难以被消化利用。在全世界，每年家禽加工业要产生数百力．吨羽毛废弃物，对环境造成了严重的污染。采用高温、高压的工艺条件将其软化，加工成动物饲料添加剂，是减少其污染环境的有效途径，但耗能大，处理过程中蛋氨酸、赖氨酸及氨酸等必需氨基酸被破坏，消化性差，营养性不稳定。利用角蛋白酶可有效地解决这一问题，它的优点在于更为经济，提高废弃角蛋白的利用率，同时产品营养价值好，而且无污染。我国的角蛋白资源极其丰富，尤其在现代农业中，大规模的家禽养殖产生了大量的角蛋白废物，其中羽毛废弃物产量最多，年产量达７０多万吨。但足大部分没有被充分利用，有的甚至造成局部的环境污染，其分泌物所含有的致病微乍物也会对人类健康造成危害。随着畜牧业的不断发展，饲料资源，尤其是动物性蛋白饲料资源的缺乏逐渐明显起来，成为养殖业发展的制约因素。按照我幽饲料工业的发展规划，至ｑ２０ｌｏ年蛋白饲料的缺口将达到３８００万吨１，羽毛废弃物的有效丌发利用对我国这种蛋白资源极度匮乏的固家有着重要的意义。１．２．５－３在制革工业中的应用脱毛工序是皮革生产过程的蘑要环节之一，传统的“毁毛脱毛”法是利用硫化物降解毛发，所排放的废水和固体废物，是导致制革废水中ＣＯＤ、ＢＯＤ和ＴＤＳ增高的丰要原冈，给环境带来，Ｔｐ驻污染。角蛋ｆ７ｌ酶能够有效地水解毛：澎巾的角质纠！织，使毛发得以从中拔』｛｛。存脱毛过秤中，使用含角蛋一酶的乍物脱毛助剂，不仅能降低脱毛废液中ＢＯＤ平ＨＴＤＳ，而且能大幅度地减少硫化物的用量甚至将其弃用，有效减少了脱毛废液对环境的污染。虽然罔内尚未见有关的研究报道，但困外的一些研究结果表明，在无硫化物的条件下，角蛋白酶的脱毛效果非常有效。１９９９年ＨｕｂｌｉｎＡ等人１１０８】将角蛋白酶用于牛皮脱毛研究发现其具有明显的脱毛能力，２００３～２００５年ｆｎＪＦｒｉｅｄｒｉｃｈ等人进行过类似的研究，结果与ＨｕｂｌｉｎＡ等人的试验结果吻合。Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ等人将菌株Ｄｏｒａｔｏｍｙｃｅｓｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕ所产角蛋白酶用于猪皮表皮、牛皮、羊毛、人的毛发及人的脚底角质层等进行降解研究。比较１数据来源于ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｎａｖｉｓｔａ．ｃｏｍ／ｂｕｓｉｎｅｓｓ／ｃｎｆｏｏｄ／ｎｅｗｓ／９９０９０１．ｈｔｍｌ１５

东华大学硕｛：学位论文１绪论猪皮表皮酶促作用前后显微形态变化，发现了该角蛋白酶用于脱毛时，不仅能有效地降解表皮，同时还作用于毛根的外根鞘以利于脱毛。值得一提的是，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ等人的研究中还选用了胶原作为该酶的作用底物，实验结果表明，该酶不分解胶原，这就解决了酶促脱毛不破坏、不损伤胶原的关键技术问题。由此可见，角蛋白酶的研究与开发在促进制革清洁化技术的发展方面有非常重要的作用。此外，２００５年Ａｎｂｕ等人从家禽饲养场的土壤中分离得到的菌株短尾帚霉（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓｂｒｅｖｉｃａｕｌｉｓ）１１Ｕ９Ｊ所产角蛋白酶同样可以在脱毛工序中有效去毛并基本去除表皮和脂腺，其研究结果为无硫生物脱毛技术的丌发与应用奠定了良好的基础。事实上，角蛋白酶在制革应用领域的研究尚处于起始阶段，对于这样一个具有材料多样性、过程多尺度性的过程，需在酶的作用机理、条件优化及角蛋白酶与其它组分相互作用规律等方面进行深入的研究。同时角蛋白酶的工业化生产技术的研究与丌发，对促进角蛋白酶在制革清洁化工艺中应用办将是未来研究的方向之一，即应用蛋白质工程方法，如定向诱变，解决角蛋白酶基因高效表达，应用代访｝］：程的相关理论与方法优化生产过程，降低成本等等。１．２．５．４在其它领域的应用角蛋白酶可应用于食品工业，如可使角蛋白降解为氨慕酸和短肽，作为营养学药物，用来生产鱼露、肉胨等高营养食品，或作为肉类嫩化剂。酶促降解所得的可溶性角蛋白是一种表面活性物质，具有良好的乳化性能，既可用作洗涤剂的活性物又ｌｌＪ。作为农药的乳化剂，例如含有４５％松节油、２２％滴滴涕、５％可溶性角蛋白、２８％水的滴滴涕乳液有良好的长期的乳化稳定性。角蛋白酶还应用于浴皂、沈发膏、润肤霜、防晒油【１ｌ和脱毛剂等美容品生产等。近年来，日本、美国、法国等世界上一些发达国家已经丌始将毛发水解物作为一类新型天然化妆品原料，成功地用于洗发、护发、固发和护肤等化妆品的生产，国内也有学者利用人发水解物作为新型防晒剂研制成功了大然防晒护肤太阳油。以毛发、羽毛、皮、毛皮、动物蹄和角等废弃角蛋白为原料生产生物可降解膜、用于复合包装膜的涂料和粘胶、农业薄膜和食用膜的研究愈加引人关注。应用角蛋白酶降解角蛋白废弃物将成为环境友好的技术。１．３选题意义和主要内容１．３．１选题意义角蛋白废弃物是一种可再生资源，可是目前尚未得到高附加值的应用，有些地方甚至造成污染，研究开发简单、可行、经济、有效的羽毛降解工艺和方法，使大量的角蛋白废物转变成可消化蛋白和复合氨基酸，将其直接应用或作为进一１６

东华人学硕上学位论文１绪论步提纯氨基酸的廉价易得的原料，从而大大提高角蛋白废弃物的利用率和利用价值，即保护环境又资源利用。这将是一个很有ｉ孑景的环保举措，并具有十分显著的经济效益和社会效益。在当前作为国内外研究热点的微生物技术领域中，我国较之国外无论是角蛋白降解菌种的分离、筛选还是角蛋白酶的分离纯化及其理化性质方面的研究都只是刚刚起步。目前国外对角蛋白酶进行的研究已涉及角蛋白酶高级结构、活性表达分子基础及酶工程等分子生物学方面的研究，集中在测出编码地衣芽孢杆菌ＰＷＤ．１菌株分泌的角蛋白酶基Ｉ困（ｋｅｒＡ）的全序列及其进一步表达。而国内对角蛋白酶的研究多停留在产角蛋白酶菌种的分离、筛选，角蛋白酶的分离纯化，角蛋白酶的理化性质方面，对其结构和作用机制的研究较少，且研究对象主要是弗氏链霉菌。当前用于发酵生产的菌种主要为弗氏链霉菌和地衣芽孢杆菌，有研究表明细菌发酵液的酶活性远远高于霉菌发酵液，因此利用细菌作为角蛋白酶的发酵生产菌具有广阔的Ｉｊ订景，而国内在这方面的研究彳’刚起步。因此，面对角蛋白酶极具潜力的应用前景，我国有必要大力开发这方面的研究。本实验室自行从腐烂的鸡毛上分离卜ｎ的荆毛角蛋白降解菌一嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ（ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＨＪ），目曲玎，因内外还未见嗜麦芽寡养译胞菌降解羽毛角蛋白的相天报道，嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ进一步丰富了我国角蛋白降解菌的资源。课题组已对此菌株通过观察菌落、菌体形态以及分子水平进行鉴定；对发酵条件进行优化，确定其最佳发酵条件；对此菌进行固定化和其卡Ｈ酶性质的研究。在这些日订期工作的基础上，本论文将要测定菌株ＤＨＨＪ所产角蛋白酶对不同来源角蛋白的降解活性，探讨该酶是否可用于其它领域；论文还对不同颜羽毛降解活性进行测定，为进一步利用该酶降解羽毛的产业化应用提供依据；另一方面，为了有利于酶的应用和克隆基因等需要，论文又对该菌所产的粗酶进一步分离提纯，探索纯化工艺条件，以获得高纯度角蛋白酶。１．３．２实验主要内容＞对本实验奎分离保存的菌种进行复壮筛选；≯对菌种分泌的角蛋白酶进行小川底物的降解实验，研究其降解范幽；＞对菌株和角蛋白酶进行／卜同颜的羽毛底物的降解实验，分析颜在角蛋白降解过程中可能产生的影响；＞对角蛋白酶进行分离纯化，主要通过硫酸铵盐析、凝胶层析、ＣＨＴ层析使其纯化，并用ＳＤＳ．ＰＡＧＥ榆验其纯度以及酶的分子量；‘≯对纯化后的角蛋白酶进行转膜，然后测定其Ｎ端氨基酸序列。１７

东毕大学硕ｔ学位论文２角蜇白降解菌粗酶的酶解潜研究２角蛋白降解菌粗酶的酶解谱研究嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ酶解谱的研究，就是测定该菌所产角蛋白酶对不同来源的角蛋白底物的酶活性。通过此角蛋白酶对不同底物的酶解实验，得出此酶对各种不同角蛋白废弃底物的降解情况，从而分析此角蛋白酶的降解范围，为此酶的工业化使用价值提供理论依据。２．１实验材料２．１．１供试细菌嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ（ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＨＪ）突变菌株Ｌ４，由本实验室分离保存。２．１．２角蛋白粉生鸡毛、鸽毛：市场收集；头发：理发店；牛毛、羊毛：屠宰场；羊角、牛角、羊蹄角：屠宰场；指甲：人羽毛粉（自制）：用沈涤剂清沈利毛，清水沈净后于灭菌锅内高眶蒸煮１ｈ，再以清水充分洗净，于８０℃烘干４８ｈ，用粉碎机将其分别粉碎后，过１００目筛。头发和羊毛、牛毛作同样的处理。牛角、羊角、羊蹄角和指甲先用洗涤剂清洗，然后烘干至恒重，用刀切成屑，再用搅拌机粉碎，过１００目筛。２．１．３药品与试剂药品与试剂蛋白胨牛肉浸膏级别生产厂商生化试剂ＢＲ生化试剂ＢＲ分析纯ＡＲ国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司氯化钠干酪素葡萄糖化学纯ＣＰ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ国药集团化学试剂有限公司浙江菱湖精细化工厂国药集团化学试剂有限公司可溶性淀粉磷酸氢二钾分析纯ＡＲ１８

东华人学硕，ｌ：学位论文２角蛋［Ｊ降解菌村ｌ酶的酶解谱研究磷酸二氢钠分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ化学纯ＣＰ国药集团化学试剂有限公司氯化钾吐温８０盐酸雷药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ超高纯ＵＰ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ化学纯ＣＰ浙江平湖化工试剂厂国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠Ｔｒｉｓ上海晶伦生物技术有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司ＴＣＡ磷酸二氢钾柠檬酸钠七水合硫酸镁甘油国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司２．１。４仪器与设备仪器与设备西贝乐多功能食品搅拌机生产厂商上海帅佳电子科技有限公司美困Ｅｐｐｅｎｄｏｆ公司移液（２０～１０雎乙）ＤＨＧ一９１２３Ａ型电热恒温鼓风干燥箱上海一叵科技有限公司美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司ＭＩＬＬＴ－Ｑ型超纯水机ＨＨ．Ｂ】１．４２０．ＢＳ．１ｌｆ乜热恒温培券箱上海跃进医疗器械厂上海通特电讯设备厂上海博迅实业有限公司医疗设备厂苏州安泰空气技术有限公司上海精科雷磁自｜限公司北京普析通川仪器有限责任公司ＹＰＷ—Ｉ型网转式恒温调速摇瓶柜ＹＱＳ．ＬＳ．ＳＩＩ全自动立式电热压力蒸汽灭菌器ＳＷ－ＣＪ—ＩＦ净化工作台ｐＨＢ，４ｐＨ计ＴＵ．１８１０紫外可见分光光度计石英比也肌Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ３２Ｒ离心机北片！普析通川仪器有限责任公司德固Ｈｅｔｔｉｃｈ公司ＨＪ．３控温磁力搅拌器分析天平（ＦＡｌ００４Ｎ型）恒温振荡器ＳＨＡ．Ｃ江苏会坛市金城团胜实验仪器厂上海精密科学仪器有限公司常州困华电器有限公司２．１．５培养基（ＷⅣ％）（１）发酵培养基葡萄糖１９，鸡毛粉２９，干酪素０．２９，氯化钾０．０３７３９，氯化钠０．０２９４９，磷酸氢二钠：磷酸二氢钾０．４：０．０３，吐温８０１９Ｏ．４９（ｐＨ７．５）

东华人学硕＋ｌ二学位论文２角盈亡ｊ降解菌枉Ｉ酶的酶解谱研究（２）活化培养基牛肉啻蛋白胨培养基：牛肉啻０．５９，蛋白胨１９，氯化钠Ｏ．５９（ｐＨ７．４～７．６）（３）基础平板培养基氯化钠０．４９，羽毛粉２９，琼脂２９，磷酸氢二钠：磷酸二氢钟０．４：０．００３（ｐＨ７５１）（４）储存培养基冻存缓冲液：磷酸二氢钾０．０６２７９，磷酸氢二钾０．０１７７９，柠檬酸钠０．０５８８９，七水合硫酸镁０．０２６４５９，甘油１０ｍＬ２．２实验和分析方法２．２．１菌株复壮将保存在斜面培养基上的菌株接种于活化培养基中４０。Ｃ、１３０ｒ／ｍｉｎ活化１２ｈ：然后耿菌悬液涂和接种于基础半板培养基，４０。Ｃ恒温培养７２ｈ；挑选单菌落接种于活化培养基再次活化，并测其角蛋白酶活性，选择酶活性较高的菌落再次涂布培养，挑选单菌落。如此反复共进行４次挑选，最后得到的就是复壮后的羽毛角蛋广１降解活性较高的菌株。将最终筛选出的菌株以菌：悬液：冻存缓冲液＝１：１的比例保存于．２０℃。２．２．２发酵培养条件将菌株ＤＨＨＪ以１％的浓度比接种于活化培养基，于４０９Ｃ恒温活化培养１２ｈ。取活化后的培养液以１０％的浓度比接种于只含鸡毛的发酵培养基中，于４０＂Ｃ、１３０ｒ／ｍｉｎ培养。２．２．３粗酶液的提取将经过７２ｈ培养的发酵培养荩在４℃下，９０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，其卜清液即为鞭酶液。２．２．４不同角蛋白底物对酶活性的影响一酶解谱的研究取粗酶液，以各角蛋白粉做底物测定发酵液上清中的酶活性。２．２．５角蛋白酶活性的测定角蛋白酶活性的测定方法参考Ｇｒａｄｉｓａｒｌ３８１，并在此基础上稍作修改。将发酵液过滤离心，取ｌｍＬ上清液，加入２．０ｍＬ０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣＩ（ｐＨ＝７．８）缓冲溶液，然后加入１０ｒａｇ羽毛粉，在４０℃恒温水浴锅中反应ｌｈ后（定时驳出用力振荡），加入２．０ｍＬ１０％ＴＣＡ终止反应。４Ｖ、９０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清２０

东华人学硕上学位论文２角蛋仁Ｊ降解菌轻ｌ酶的酶解谱研究液于２８０ｎｍ波长处测定其吸光度。反应前即加ＴＣＡ处理用作对照。酶活性定义：Ａ２８０值每增加Ｏ．１为ｌｕｎｉｔ（Ｕ）。２．３结果与讨论２．３．１针对不同类型的角蛋白进行降解谱的实验结果对软质角蛋白（鸡毛，鸽子毛，牛毛，羊毛，头发）和硬质角蛋白（牛角，羊角，羊蹄角，指甲）角蛋白酶降解后的酶活性测定结果（见图２－１和２．２）。６５４３２１Ｏ●酶活性／Ｕ鸡毛鸽毛牛毛羊毛头发图２．１不同软质角蛋白作底物时的酶活性Ｆｉｇｕｒｅ２一ｌＥｎｚｙｍｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｆｔｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｂｙｔｈｅｃｒｕｄｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅ６５４３２１０■憾活性／Ｕ鸡毛牛角羊角羊蹄角指甲图２．２不同硬质角蛋白作底物时的酶活性Ｆｉｇｕｒｅ２－２Ｅｎｚｙｍｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈａｒｄｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｂｙｔｈｅｃｒｕｄｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅ２１

东华人学硕＿Ｊ：学位论文２角蛋白降解菌狂ｌ酶的酶解辫研究２．３．２实验结果讨论羽毛中包含质量百分比为９１％的蛋白质，８％的水和ｌ％的其它液体，其蛋自质是一种含硫的无纤维状的蛋白质。羽毛角蛋白在结构上与哺乳动物毛发角蛋白不同，主要由缠绕的Ｂ．折叠角蛋白构成。羽轴的皮质层由两个不同的层组成，内层角蛋白纤维方向平行于羽轴，外层角蛋白纤维方向沿圆周方向分布，二者的生化成分相同，都是Ｂ角蛋白。羽轴根部外侧角蛋白层较厚，占羽轴厚度的１／７，沿羽尖方向其厚度逐渐变小１１１】。实验所选的鸡毛鸽毛同属于羽毛一类材料，实验的结果显示角蛋白酶对其的降解程度大致是相同的，可以推测角蛋白酶对其它结构类似的羽毛类的物质的降解效果也相似。头发含质量百分比８０％以上的角蛋白，具分级结构。头发由毛干和毛囊两部分组成。毛干可分为毛小皮、皮质和髓质３层。毛小皮为毛干的最外层，由３～７层扁平细胞交错重叠成鳞片状，从毛根排列至毛梢，包裹着内部的皮质：皮质层紧密地阐绕在髓质周围，是头发的辛要成分，皮质细胞由许多粗纤维、细纤维和原纤维组成，原纤维直径仅２ｎｍ，由２＂－＇３股ａ．螺旋角蛋白组成，原纤维再排列成微纤维，直径为８ｎｍ，微纤维包埋在由高硫蛋白组成的无定形细胞基质中，上百根微纤维又结合成不规则的纤维束，直径约２００ｎｍ；髓质位于毛干的中心，由２～３层多角形细胞组成。羊毛足动物纤维的一种，由１８种氨罐酸组成，其中胱氨酸残基占１２％，按其性质也可分为鳞片层、皮质层和髓质层３个组织层次，基本结构与头发相似…ｏ】。本实验选择的牛毛、羊毛和头发的实验结果发现，牛毛和头发的降解效果比羊毛的明显，原因可能为选用的羊毛为绵羊羊毛，毛发本身附着的油脂很多，难以清洗去除，这町能给酶解带来负面影响，但是否脂类物质对酶解有负面影响还要进一步的实验确定。但总体来看，毛发类底物的降解效果没有羽毛类的明显，这可能说明在软角蛋白底物材料中，角蛋白酶对含有ａ角蛋白的底物的降解程度低于含Ｂ角货门的底物。蹄角角蛋白材料是山ａ．螺旋纤维嵌入球状蚩自的无定形皋质中构成的，它是一种艘质角蟹门材料。其微纤维的ａ。螺旋部分为稳定的品念结构。硬角赁自的琏质除了和软角蛋白一样富含半胱氨酸外，还含一种富含卞｜．氨酸和酪氨酸的蛋白质。半胱氨酸一半胱氨酸的二硫化物交联使微纤维’ｊ富含半胱氨酸的基质结合稳定，其余基质的稳定性丰要依靠氢键作用Ｉｎ】。实验选用的牛角、羊角和指甲属于这一类物质，实验的结果显示，角蛋白酶对此类硬质角蛋白的降解效果优于毛发类的物质。由于实验对所有的角蛋白底物材料均进行了粉碎处理，角蛋白材料本身的与结构相关的功能丧失，因此，这可能是角蛋白酶对蹄角等硬质角蛋白材料的降解不低于毛发等软质角蛋白材料的原因。另外，此类硬质角蛋白材料较之软质角蛋白中富含甘氨酸和酪氨酸，角蛋白酶可以利用此蛋白质提高活性，这也可能是另一方面的原因。角蛋白酶对各物质的降解机理、各底物材料的结构性能是

东华人学硕上学位论文２角蛋Ｅｊ降解菌粗【酶的酶解谱研究否影响酶的降解还需进一步设计实验进行分析。２．４本章小节本实验的结果，鸡毛和鸽毛角蛋白同属于８角蛋白，角蛋白酶对其降解的酶活性明显高于其余各种角蛋白，说明嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ产生的酶对含Ｂ角蛋白的角蛋白材料的降解效果较好。另外，虽然羊毛、头发、牛毛和鸡毛、鸽毛同属软质角蛋白，但是前三者都是哺乳动物毛发，结构中所含的是ａ角蛋白，与鸡毛和鸽毛有区别的。硬质角蛋白（牛角，羊角，指甲，羊蹄角），虽然其角蛋白成分也为ａ角蛋白，但是酶活性却略高于软质角蛋白（羊毛，头发，牛毛）。总之，将角蛋白底物材料经过粉碎等处理后，本实验所选角蛋白酶的酶解效果按顺序如下：软质角蛋白中的羽毛类＞硬质角蛋白＞软质角蛋白中的毛发类。ＦｒｉｅｄｒｉｃｈｌｌｌｌＪ对Ｄｏｒａｔｏｍｙｃｅｓｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ的研究发现其对不同底物的降解程度有如下关系：皮肤角蛋自＞指甲角蛋白＞头发角蛋白，其中指甲等硬质角蛋白的降解程度大于头发等毛发类的软质角蛋白的研究结果和本实验是相类似的。～国内外的角蛋白酶的相关研究中，有关酶解潇的研究报道较少，但已知很多菌株对羊毛和猪皮有降解效果。据Ｅ１．Ｎａｇｈｙ［¨２Ｊ等对Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｇｅｏｒｇｉａｅ的研究表明，Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｇｅｏｒｇｉａｉｆｆ降解鸡毛和鸭毛，但是埘羊毛、牛毛和头发完全没有降解能力。Ｄｏｒａｔｏｍｙｃｅｓｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ对皮肤角质层的降解效果很明显，但是对人的头发、羊毛和鸡毛培养后的底物中却检测不到降解底物１１¨ｌ。多数角蛋白酶优先利用动物角蚩白，而对人类角蛋白（尤其是头发）利用率较低或者根本不利用１８刀。本实验中，嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ所产角蛋白酶对各类角蛋白底物的降解说明此角蛋白酶的酶解范围相当广泛，具有开发应用价值。

东华人学硕十学位论文３颜对角蛋（ｊ降解的影响３颜对角蛋白降解的影响在实验的过程中发现，不同颜的羽毛其菌株的降解效率会有所不同。通过设计实验，选择三种不同颜的羽毛（取自同一养殖场的鸡，使各颜的羽毛的长度和重量尽量相等，假定各种颜的羽毛样品对酶和菌株的降解作用表面是相同的），一方面以完整羽毛作为发酵培养基中研究菌株的降解效果，另一方面以粉碎后的各羽毛粉同时作为发酵和酶解的底物，研究菌株对羽毛粉的降解和角蛋白粗酶直接酶解不同颜的羽毛粉的效果，以此得出结论，并将各结论进行对比分析，探求颜对角蛋白降解的影响原因，为羽毛降解过程中存在的其它的不利影响因素提供相关的解决依据。３．１实验材料３．１．１供试细菌嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ由本实验室分离保存。３．１．２角蛋白粉ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＨＪ）突变菌株Ｌ４，生鸡毛：取自同一养殖场的鸡，使各颜的荆毛的长度和重量尽量相等，假定各种颜的羽毛样品对酶的作用表面是相同的；羽毛粉（自制）：用洗涤剂清洗习习毛，清水洗净后于灭菌锅内高压蒸煮１ｈ，再以清水充分沈净，于８０℃烘干４８ｈ，用粉碎机将其分别粉碎后，过１００日筛。３．１．３药品与试剂药品与试剂蛋白胨牛肉浸膏氯化钠干酪素葡萄糖可溶性淀粉磷酸氢二钾磷酸二氢钠级别生产』＋。商生化试剂ＢＲ生化试剂ＢＲ分析纯ＡＲ国药集训化学试剂有限公司崮药集团化学试剂有限公司囤药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司浙江菱湖精细化工厂国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司化学纯ＣＰ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ２４

东华人学硕’Ｌ学位论文３颜对角蛋白降解的影响氯化钾分析纯ＡＲ国药集团化学试剂有限公司吐温８０盐酸化学纯ＣＰ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ超高纯ＵＰ分析纯ＡＲ图药集团化学试剂有限公司浙江平湖化工试剂厂氢氧化钠ＴｒｉｓＴＣＡ国药集团化学试剂有限公司上海晶伦生物技术有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司考马斯亮蓝Ｇ２５０９５％乙醇磷酸ＢＳＡ。生化试剂分析纯ＡＲ国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司上海源聚生物科技有限公司分析纯ＡＲ生化试剂３．１．４仪器与设备仪器与设备生产厂商上海帅佳电子科技有限公司美圈Ｅｐｐｅｎｄｏｆ公司西贝乐多功能食品搅拌机移液（２０－１００／卫Ｌ）ＤＨＧ．９１２３Ａ型电热恒温鼓风干燥箱ＭＩＬＬＴ－Ｑ型超纯水机ＨＨ．Ｂ１上海一恒科技有限公司美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司上海跃进医疗器械厂１．４２０．ＢＳ．ＩＩ电热恒温培养箱ＹＰＷ－Ｊ型回转式恒温调速摇瓶柜ＹＱＳ—ＬＳ．ＳＩＩ全自动立式电热压力蒸汽灭菌器上海通特电玳设备厂上海博迅实业有限公司医疗设备ｒＳＷ－ＣＪ．１Ｆ净化工作台ｐＨＢ一４苏州安泰空气技术有限公司上海精科雷磁有限公司ｐＨ计ＴＵ一１８１０紫外可见分光光度计石英比皿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ３２Ｒ离心机ＨＪ．３控温磁力搅拌器分析天平（ＦＡｌ００４Ｎ型）恒温振荡器ＳＨＡ．Ｃ３．１．５培养基（Ｗ／Ｖ％）（１）发酵培养基北京普析通用仪器有限责任公司北京普析通用仪器有限责任公司德州Ｈｅｔｔｉｃｈ公司江苏会坛市会城团胜实验仪器厂上海精密科学仪器有限公司常州｜＝ｌ司华电器有限公司葡萄糖１９，鸡毛粉２９，干酪素０．２９，氯化钾０．０３７３９，氯化钠０．０２９４９，磷酸氢二钠：磷酸二氢钾０．４：０．０３，吐温８００．４９（ｐＨ７．５）（２）活化培养基

东华人学硕一ｌｊ学位论文３颜对角蛋［Ｊ降解的影响牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏０．５９，蛋白胨ｌｇ，氯化钠０．５９（ｐＨ７．４＂－－＇７．６）３．２实验和分析方法３．２．１发酵培养条件同２．２．２３．２．２粗酶液的提取同２．２．３３．２．３不同颜羽毛对酶活性的影响（１）将菌株以１％的浓度比接种于活化培养基，于４０。Ｃ恒温活化培养１２ｈ。取活化后的培养液以１０％的浓度比接种于含各种颜的羽毛的发酵培养基中，于４０９Ｃ、１３０ｒ／ｍｉｎ培养，取上清液测定酶活性。未接种的锥形瓶作为机械作用对羽毛损毁情况的对照；（２）上述方法中的羽毛换成同等质量的荆毛粉，不设对照，其余条件相同；（３）直接取培养７２ｈ后提取的粗酶液，以各种颜的羽毛粉作为酶解底物测定酶活性。３．２．４蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝染法）１１１３】（１）试剂制备·考马斯亮监试剂：称取考马斯亮蓝Ｇ．２５０１００ｍＬ。加入９５％Ｋ，醇５０ｍＬ，使之溶解，再加入８５％磷酸ｌＯＯｍＬ、蒸馏水１０００ｍＬ，混匀，避光放置过夜。然后用两层滤纸过滤，滤液用棕瓶保存，至少可保存两周。·标准蛋白质ＢＳＡ溶液５毗ｇ·ｍＬ一。（２）取试管３支，编号，按表３．１操作。表３－１考马斯亮蓝法测定蛋白质Ｔａｂｌｅ３—１ＤｅｔｅｒｍｉｎａｌｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈＢｒａｄｆｏｒｄｍｅｔｈｏｄ（３）混匀，室温放置５ｍｉｎ，在波长５９５ｎｍ处，以空白管调零点。测定各管的吸光度值。２６

东华大学硕士学位论文３颜对角蛋白降解的影响（４）按照下面的公式计算样品中蛋白质的含鄞∥乩）２恚×５０３．２．５角蛋白酶活性的测定同２．２．５３．３结果与讨论３．３．１不同颜的羽毛底物的酶解研究实验结果（１）用各种颜的羽毛代替羽毛粉作为发酵培养基的组分，经过发酵培养后取上清液测定酶活性和蛋白质含量，结果见图３．１、３－２。８７６５４ｎ／越烬嚣３２１Ｏ１２３４５时间／ｄ＋对照＋白十棕十灰＋黑图３－１完整羽毛的颜对酶活性的影响Ｆｉｇｕｒｅ３－１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｔａｃｔｆｅａｔｈｅｒｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｒｏｎｋｅｒａｔｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ２７

东华人学硕士学位论文３颜对角蛋白降解的影响７６５ｔ－昌－－４＼∞ｅ面嚼４缸３蜒皿２嘲Ｏ１２３４５时间／ｄ＋对照＋白＋棕＋灰－ＩＩ卜黑图３．２菌株降解羽毛后蛋白质含量对比Ｆｉｇｕｒｅ３－２Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔａｆｔｅｒｄｅｇｒａｄｉｎｇｂｙｍｕｔａｎｔｂａｃｔｅｒｉａ（２）羽毛粉发酵培养，取上清液测定酶活性，结果见图３—３。８７ｏ＼６划魍链５４３１２３４５时间／ｄ＋向＋棕十灰＿卜黑图３．３羽毛粉的颜对酶活性的影响Ｆｉｇｕｒｅ３－３Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆｅａｔｈｅｒｐｏｗｄｅｒｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｒｏｎｋｅｒａｔｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ（３）将各种颜的羽毛磨碎成粉，过１００目筛，直接取培养７２ｈ后提取的粗

东华大学硕十学位论文３颜对角蛋白降解的影响酶液，以各种颜的羽毛粉作为酶解底物测定酶活性，取三组平行对照，结果见表３—２，取平行组中闻值作图，结果见图３－４。表３．２水解不同颜的羽毛粉时的酶活性Ｔａｂｌｅ３－２Ｅｎｚｙｍｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｆｅａｔｈｅｒｐｏｗｄｅｒｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｒ６５４３２１Ｏ■酶活性／ｕｊ白棕灰黑图３－４水解不同颜的羽毛粉时的酶活性Ｆｉｇｕｒｅ３－４Ｅｎｚｙｍｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｆｅａｔｈｅｒｐｏｗｄｅｒｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｒ３．３．２实验结果讨论由图３．１和图３．２可以看出，当羽毛比较完整的时候，ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＨＪ对不同颜的羽毛的降解作用是不同的，以颜越浅降解的效果越好，降解产生的蛋白质也越多，颜比较接近时，这种降解的优势差别不显著，如棕和灰羽毛的降解。ＧｅｒａｌｄＧｏｌｄｓｔｅｉｎ等１１１４ｌ对Ｂ．１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ降解不同颜的羽毛做了研究，其研究发现在２３０ｎｍ处，黑羽毛发酵液吸光值低于白羽毛发酵液，而２３０ｎｍ处的吸光值反映的是降解产物之一——寡肽的含量，这就说明了黑羽毛的降解程度低于白羽毛。本实验获得的结论和ＧｅｒａｌｄＧｏｌｄｓｔｅｉｎ的结论一致。直接以粉碎的羽毛粉作为发酵底物时的酶活性见图３．３，粉碎后的各种颜的羽毛粉做底物时，其酶活性大致都相等。由于发酵培养基中还有其它营养物质，为了能够说明颜对酶解的影响，进一步直接用从发酵培养基中提取的粗酶液，

东华大学硕士学位论文３颜对角蛋白降解的影响以不同颜的羽毛粉作为测量酶活性时的底物，即酶解底物，结果见表３．２和图３．４。可以看出，当羽毛经过粉碎等机械外力的损毁后，ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＩ－ＩＪ产生的角蛋白酶对以各羽毛粉作为发酵底物或酶解底物时的酶活性都几乎是相同的。以上结果可能说明了黑素的存在增加了羽毛的结构上的耐磨性，从而才降低了细菌对完整羽毛的降解，也反映了黑素可能并没有直接抑制酶活性。这与Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ—Ｈｏｌｍ［１１５】等的研究结论不同，其研究认为黑素可能直接对细菌产生影响，根据对棕鳟鱼（Ｓａｌｍｏｔｒｕｔｔａ）的研究发现，其细菌感染区附近的皮肤组织变黑，阻止了传染的进一步扩大，抑制产生的直接原因还不清楚，但他们认为或许是黑素抑制了酶活性，从而降低细菌降解深羽毛的速率。关于颜对羽毛降解的影响可以看做黑素对羽毛降解的影响，目前所做的研究得出的结论还不能完全解释这一现象，大部分理论倾向于黑素对羽毛结构上起到某种作用，这种作用间接导致了羽毛的抗降解性能。Ｂｏｎｓｅｒ等【１１６】认为羽毛中的黑素增强了它们的抗蚀性和抗菌降解性，复杂的协同作用机制可能解释这一影响。黑素是小颗粒蛋白质，分布于黑或棕等有羽毛或羽毛倒钩外层的Ｂ角蛋白的片层结构上。因此，黑或棕等有羽毛的外层是合成材料，根据已知情况，这种材料的强度大于来自白羽毛外层的不含黑素的Ｂ角蛋白等非合成的材料，比非黑素羽毛角蛋白的硬度高３９％。材料的磨损率与硬度成反比，因此硬材料比软材料耐磨。黑素角蛋白与非黑素角蛋白有不同的力学特性，因而可能导致不同的耐磨性。Ｖｏｉｔｋｅｖｉｃｈｌｌｌ～旨出含黑素的羽轴和倒钩的外层比不含黑素的羽轴和倒钩的外层要厚。厚的外层也许能使含黑素的羽毛在粉碎前对剥蚀和细菌降解的破坏产生更大的抵抗性，但是厚的外层不会使含黑素的羽毛培养基中的寡肽片断的浓度低于不含黑素的羽毛培养基。这些差异表明，当Ｂ角蛋白的片层结构含黑素颗粒时，角蛋白酶的水解作用要弱于不含黑素颗粒时。不同于ａ角蛋白较为简单的螺旋状结构，Ｂ角蛋白结构复杂，它山连接相同或小同分子侧链的二硫键组成的折叠片层结构构成。生长过程中的羽毛角蛋白结构上的黑素颗粒的存在或许提供附加的表面，从而使硫原子紧密相连，使得Ｂ角蛋白分子内或分子之间的硫原子发生接触反应而结合起来。如果酶的活性位点不能扩展到增加的二硫键桥接上，则Ｂ角蛋白的降解将很大程度地降低。黑素的存在增加了羽毛的抗蚀性，这对飞禽羽毛至关重要，也是呈现黑的最主要的物质。Ｂｕｒｔｔ和Ｉｃｈｉｄａ指出，太平洋西北部（相对湿度很高）的黑歌雀羽毛上的地衣芽孢杆菌菌株降解羽毛比亚利桑那东南部（相对湿度低）的灰歌雀羽毛上的地衣芽孢杆菌菌种降解羽毛的速度快且更为彻底。早在１８３３年Ｇｌｏｇｅｒ就曾提出相对湿度高的环境多长黑羽毛，相对湿度低的环境则长灰的

东华大学硕上学位论文３颜对角蛋白降解的影响羽毛，这种现象在大多数种类的鸟类中都可以发现，据此判断，除了其它功能，鸟类选择含有黑素的羽毛的一个重要的有利因素是，含有黑素的羽毛可抵抗细菌的降解，而这些细菌是存在于鸟类生活空间之中的【１１４】。羽毛磨损对家禽饲养业有很大影响，严重的羽毛磨损需要对家禽饲料进行改进。另外，羽毛磨损也影响鸟的飞行质量。很多研究者证实黑素角蛋白比较耐磨，然而目前仍无材料特性因素方面的解释。而Ｂｕｒｒ证实，当羽毛受到固体颗粒磨料磨损时，黑素影响磨损速率，并指出这是绝大多数沙漠鸟类都具有黑素翅膀的缘故；还发现非黑素的羽枝更易断裂，而黑素会降低羽枝断裂的几率。这些研究表明黑素成分的变化引起羽毛磨损抗力的不同，但未解释这是否是由于两种角蛋白内部材料性能的差异引起的【１１１。３．４本章小节对不同颜的羽毛的研究发现，只有当羽毛完整无破损时，颜才对羽毛降解产生影响，且颜越深降解效果越差，一旦羽毛经过破碎，结构上的优势被打破，黑素便无影响，说明黑素对羽毛降解的影响可能只是增加其结构上的优势，这也说明了在羽毛发酵前进行适当的处理是非常必要的，可以降低羽毛自身结构对降解产生的不利影响。在进行工业化发酵生产时，应尽可能将羽毛破碎，以降低黑素对羽毛降解产生的不利影响，尝试将不同颜的羽毛分开处理，颜较浅的羽毛简单处理，以节省能耗，颜较深的羽毛处理的程度适当加大。黑素对羽毛磨损抗力的影响、对角蛋白材料结构上的作用，与角蛋白材料的摩擦行为学关系密切，开展角蛋白材料摩擦学研究对于生物摩擦学乃至仿生摩擦学研究是一项有意义的探索，因此，进一步研究黑素在角蛋白结构上对细菌降解的影响是很有意义的。本实验仅仅研究了不同状态下的各羽毛降解程度的对比，黑素在羽毛降解过程中起到的具体作用还需进一步实验分析。３１

东华人学硕一ｌｊ学位论文４角蛋白酶的纯化４角蛋白酶的纯化由已经进行的各项针对ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＨＪ的研究证实，这株本实验室筛选、分离并保存的菌株，在降解各种角蛋白废弃物中具有巨大的应用价值。之前所做的研究工作是针对细菌的生长产酶条件的优化、以及粗酶液的各项理化性质，同时也对粗酶液进行降解机制方面的研究。研究显示２，嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ（ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＨＪ）突变菌株的粗酶液理化性质如下：最适作用ｐＨ为７．８，最适作用温度为５０℃，在ｐＨ７．０～８．Ｏ，６０℃以下酶活性较稳定。Ｃａ２＋，Ｂａ２＋，Ｃｕ“，Ｎａ＋，Ｋ＋ＦＦ【ＩＭ９２＋离子对粗酶活力有促进作用，而Ｈ９２＋，Ｃｄ２＋，Ｐｂ２＋，Ｚｎ２＋和ＰＭＳＦ则对粗酶活力有抑制作用，根据抑制剂的类型和抑制程度，可以推测嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ（ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓＤＨＨＪ）产生的角蛋白酶应属于丝氨酸蛋白酶。ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ但是由于粗酶液中含有其它未知降解成分，所做的研究只能是初步推断，因此，有必要进行角蛋白酶的纯化，研究纯酶的各项理化性质，如最适温度、ｐＨ、抑制和激活反应、酶的耐热性和耐酸碱的稳定性等等，以了解酶的各项性质，并和其它种类角蛋白酶进行比较，为进一步实现酶的工业化提供参考意见。此外，纯化后的酶进行测序，研究其核苷酸序列，从基因上分析酶的性质，也可为酶的降解机制提供理论上的参考意见，同时为编码基因的克隆、以及克隆后的基因在角蛋白降解过程中的时空表达顺序等打下基础。本次纯化角蛋白酶的研究是在之前所做的粗酶液的理化性质研究的基础上展开的，主要是根据现有实验室的实验条件，选择适合角蛋白酶的纯化方式，最终选用的是硫酸铵盐析、凝胶层析和ＣＨＴ层析，纯化的效果主要是根据层析过程中ＢｉｏＬｏｇｉｃＬＰ层析系统的图谱出峰情况，并采用常用的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ进行最后的纯化检验。并对纯化后的角蛋白酶进行了转膜处理和测序工作。４．１实验材料４．１．１供试细菌嗜麦芽寡养单胞菌ＤＨＨＪ（ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａＤＨＨＪ）突变菌株Ｌ４，由本实验室分离保存。４．１．２角蛋白粉生鸡毛：市场收集：２数据来源于王晶学位论文：《～株新的羽毛角蛋白降解菌的鉴定、研究与应用》，东华大学，２００６，Ｐ５９。３２

东华人学硕上学位论文４角蛋白酶的纯化羽毛粉（自制）：用洗涤剂清洗羽毛，清水洗净后于灭菌锅内高压蒸煮１ｈ，再以清水充分洗净，于８０℃烘干４８ｈ，用粉碎机将其分别粉碎后，过１００目筛。４．１．３药品与试剂药品与试剂蛋白胨牛肉浸膏氯化钠干酪素葡萄糖可溶性淀粉磷酸氢二钾磷酸二氢钠氯化钾吐温８０盐酸氢氧化钠ＴｒｉｓＴＣＡ考马斯亮蓝Ｇ２５０９５％乙醇无水乙醇甲醇磷酸硫酸铵ＢＳＡＡｃｒＢｉｓ考马斯亮蓝Ｒ２５０ＳＤＳ溴酚蓝ＡＰＴＥＭＥＤＤ１Ｔｒ硝酸银级别生化试剂ＢＲ生化试剂ＢＲ分析纯ＡＲ化学纯ＣＰ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ化学纯ＣＰ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ超高纯ＵＰ分析纯ＡＲ生化试剂分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ生化试卉Ｕ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ分析纯Ａｌｌ电泳纯生化试剂ＢＲ分析纯ＡＲ分析纯ＡＲ生化试剂ＢＲ分析纯ＡＲ３３生产厂商国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司囤药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司浙江菱湖精细化工厂国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司浙江平湖化工试剂厂国药集团化学试剂有限公司上海晶伦生物技术有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司上海源聚生物科技有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司上海如吉生物科技有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司上海精细化工材料研究所

东华人学硕卜学位论文Ｇｌｙ分析纯ＡＲ甘油分析纯ＡＲ冰醋酸分析纯ＡＲＢ毓基乙醇分析纯ＡＲ甲醛分析纯ＡＲ戊二醛分析纯ＡＲ硫代硫酸钠分析纯ＡＲ碳酸钠分析纯ＡＲ聚乙二醇（二万）分析纯ＡＲＥＤＴＡ分析纯ＡＲ低分子量标准蛋一ＣＡＰＳ分析纯ＡＲ４．１．４仪器与设备仪器与设备西贝乐多功能食品搅拌机移液（２０－ｌＯＯ∥Ｌ）移液（１－２０／ＭＬ）移液（１００～ｌＯＯＯ＃ＵＤＨＧ一９｜２３Ａ型电热恒温鼓风干燥箱ＭＩＬＬＴ－Ｑ型超纯水机ＨＨ．Ｂ１１．４２０一ＢＳ．ＩＩ电热恒温培养箱ＹＰＷ－Ｉ型回转式恒温调速摇瓶柜ＹＱＳ．ＬＳ—Ｓ１１全自动立式电热压力蒸汽灭荫器ＳＷ—ＣＪ．１Ｆ净化工作台ｐＨＢ一４ｐＨ计ＴＵ一１８１０紫外ｉ·Ｊ．见分光光度计石英比皿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ３２Ｒ离心机ＨＪ一３控温磁力搅拌器分析天平（ＦＡｌ００４Ｎ型）恒温振荡器ＳＨＡ．ＣＢｉｏ，Ｒａｄｍｉｎｉ电泳稽Ｂｉｏ—ＲａｄＰｏｗｅｒＰａｃＢａｓｉｃ４角拦［｜酶的纯化Ｊａｐａｎｑｃｂｉｏ进口分装国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司上海升ｉＦ生物技术有限公司Ｊａｐａｎｑｃｂｉｏ进口分装生产厂商美国Ｅｐｐｅｎｄｏｆ公司美困Ｅｐｐｅｎｄｏｆ公司上海一恒科技有限公司美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司上海博迅实业有限公司医疗设备ｒ苏州安泰窄气技术自．限公胡上海精科霄磁有限公司北京普析通Ｊｆｊ仪器有限责任公司北京普析通用仪器有限责任公司德围Ｈｅｔｔｉｃｈ公司江苏会坛市金城国胜实验仪器厂上海精密科学仪器有限公司常州国华电器有限公司美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司上海帅佳电子科技有限公司美国Ｅｐｐｅｎｄｏｆ公司上海跃进医疗器械厂上海通特电讯设备厂

东华大学硕十学位论文４角蛋白酶的纯化Ｂｉｏ．Ｒａｄｍｉｎｉ电转槽ＬＰ层析系统ＦｒａｃｔｉｏｎＣｏｌｌｅｃｔｏｒ美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司ＢｉｏＬｏｇｉｃＢｉｏ—ＲａｄＭＯＤＥＬ２１１０转移脱摇床ＴＳ．８型ＣＨＴ柱（１ｍＬ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ海门其林贝尔仪器制造有限公司美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司Ｇ．１００凝胶颗粒ｐｈａｒｍａｃｉａ公司上海锦华层析设备厂层析柱（１ｃｍｘ４５ｃｍ）透析袋（ＭＷＣ０３５００）ＰＶＤＦ膜Ｔａｎｏｎ３５００凝胶成像系统上海绿鸟科技发展有限公司分装美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司上海天能科技有限公司４．１．５培养基（ｗⅣ％）同３．１．５４．２实验和分析方法４．２．１发酵培养条件同２．２．２４．２．２粗酶液的提取同２．２．３４．２．３硫酸铵盐析的原理和方法４．２．３．１原理蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－－ＣＯＯＨ、－－ＮＨ２和－－ＯＨ都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成１ｎｍ～１００ｎｍ颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之问的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。４．２．３．１方法在粗酶液中加入４％、７％、１０％、１５％、２０％浓度的硫酸铵（Ｗ／Ｖ），轻轻搅拌溶液使硫酸铵溶解充分，将溶液置于４。Ｃ冰箱中１，－－，２ｈ，期问取出轻轻摇晃溶液，３５

东华人学硕卜学位论文４角蛋臼酶的纯化最后将溶液于９０００ｒ／ｍｉｎ离心机中离一６，２０ｍｉｎ，离心管壁上所附着物质即为分离蛋白质，将溶液倾去，留此蛋白质，用尽可能少的去离子水溶解此蛋白质，吸取少量溶液留作电泳用，其余溶液稀释至原浓度测其蛋白质含量及酶活性。４．２．４凝胶层析的原理和方法４．２．４．１原理凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）和琼脂糖凝胶（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）。葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂３．氯１，２一环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂韵比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孑Ｌ的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。葡聚糖凝胶层析，是使待分离的物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不例，而在层析柱ｒｆｌ以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范幽的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂存凝胶颗粒之问流动，凶此流程短，而先流ｍ层析柱：分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔肉，阻滞作硝大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分ｒ量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离的目的。４．２，４．２操作方法①凝胶的制备：商品凝胶足Ｔ燥的颗卡晓，使用时需经溶胀处理，称取２克葡聚糖凝胶ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．１００，］Ｊｒｌ８０ｍＬ去离子水，１００℃∥ｂ水浴溶胀５ｈ。用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，加入凝胶等体积的１．０ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液处理，用玻璃棒轻轻搅动，并浸泡１ｈ后倾去。用去离子水洗涤数次，再以磷酸缓冲液冲洗，使其ｐＨ值至中性。将ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一１００凝胶水溶液盛放于抽虑瓶中，用洗耳球塞住杯口，减握抽气３０ｍｉｎ，除去凝胶溶液内的气泡，将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入烧杯中，其中盛有１／２去离子水。②装柱：将层析柱洗净，柱的上下端装好塑料管，垂直固定在铁支架上。校直过程用

东华大学硕十学位论文４角蛋白酶的纯化下端绑有钥匙的绳子挂于铁架的不同位置，从多角度校正使柱垂直。打开层析柱上端口，加入洗脱液，使洗脱液从层析柱下端出口流出，排除残留气泡，最后保留约２ｃｍ高的洗脱液，关闭出口端。将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过ｌｃｍ时，打开出口端，使洗脱液以一定流速流出，同时继续装柱，直到沉积的的凝胶床面与柱顶端相距５ｃｍ左右时停止装柱，关闭出口端。装柱过程中严禁产生气泡，避免出现分层。柱装好后检查凝胶沉积到柱内是否均匀，是否有纹路和气泡，若层析柱不均匀，必须重新装柱。③平衡：将装好的柱子安装于Ｂｉｏ．Ｒａｄ层析系统中（系统已经进行管道冲洗），检查管路连接紧密性，确保无泄漏之后，以ｐＨ７．５、０．２Ｍ的磷酸钠缓冲液平衡层析柱，流速为０．５ｍｌＪｍｉｎ，用３—５倍体积缓冲液平衡层析柱，直至检测系统中电导率和吸光值两条基线平衡（大概丽个小时左右）。④上样：上样前打开层析柱上端，先检查凝胶床界面是否平整，如果倾斜不平整，可用玻璃棒将凝胶床界面轻轻搅起后，再使凝胶自然沉降，形成平整状态的凝胶床界面。用毛细吸管小心吸去大部分清液，然后让液面自然下降，直至几乎露出凝胶床界面。将１００ｒｎＬ发酵液用１０％硫酸铵盐析，得到的样品进行透析浓缩后上样。样品要先放入高速离心机中，１２０００ｒ／ｒａｉｎ，离ｄｌ，５ｍｉｎ。上样前要吸取少量样品于ＥＰ管中，以备走电泳。取０，５ｍＬ的样品溶液由玻璃棒引流沿壁加入到凝胶床面上，注意不要使床面凝胶冲起。待样品自然下降进入凝胶床，等其完全进入之后加洗脱液（洗脱液同平衡液１至３ｃｍ高度，打开层析系统开始洗脱，控制洗脱流速，使凝胶床面不能脱水，且样品的区带尽量狭窄，设定收集系统参数。⑤沈脱和收集：经多次实验摸索，洗脱流速为０．４ｍＵｍｉｎ，收集管每管收集１ｍＬ，收集３０管，样品就可以完全被洗脱下来。将收集到的有蛋白质活性的每管进行合并，然后测定总酶活和蛋白质含量。４．２．５ＣＨＴ层析的原理和方法４．２．５．１原理ＣｔｔＴ具有独特的分离机理，是唯一直接用于蛋白质和核酸纯化的无机层析填料，高度耐碱，生物安全性最高。其中Ｐ０４３－离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换特性，可由ＮａＣｌ浓度梯度或磷酸钠浓度梯度洗脱，其中的Ｃａ２＋３７