Stenotropho monasmaltophilia产角蛋白酶对羊毛的作用机理探讨

第３０卷第１期　生物学杂志　Ｖｏ１．３０　Ｎｏ．１　２０１３年２月　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬ０ＧＹ　Ｆｅｂ．２０ｌ３　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５—１７３６．２０１３．０１．０４７　Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｈｏｐｈｉｌｉａ产角蛋白酶对羊毛的作用机理探讨　李贲　，吴建明　，朱华君　，王强　，王平　，范雪荣　（１．江南大学生态纺织教育部重点实验室，无锡２１４１２２；２．宁波雅戈尔毛纺织染整有限公司，　宁波３１５１９２；３．无锡协新毛纺织有限公司，无锡２１４１９２）　摘要：采用Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ产角蛋白酶降解羊毛角朊蛋白，通过测定反应前后残液中巯基和肽键的变　化探讨角蛋白酶作用机理。结果表明，角蛋白酶主要作用是断裂角蛋白中的二硫键，也能降解大分子蛋白质，但作　用效果不强。羊毛胱氨酸分析结果进一步证明角蛋白酶能断裂羊毛鳞片层中胱氨酸二硫键。ＳＥＭ结果显示单独　使用角蛋白酶对羊毛鳞片去除效果不佳，但角蛋白酶和蛋白酶二浴法工艺能有效降解、剥离羊毛鳞片。　关键词：角蛋白酶；二硫键；羊毛；作用机理　中图分类号：Ｑ５５６　．９；ＴＳ１９５．１　文献标识码：Ａ　文章编号：２０９５—１７３６（２０１３）Ｏｌ一００４７—０４　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ　ｏｎ　ｗｏｏｌ　ＬＩ　Ｂｅｎ　，ＷＵ　Ｊｉａｎ—ｍｉｎｇ　，ＺＨＵ　Ｈｕａ－ｊｕｎ　，ＷＡＮＧ　Ｑｉａｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｐｉｎｇ　，ＦＡＮ　Ｘｕｅ—ｒｏｎｇ　（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｅｃｏ－Ｔｅｘｔｉｌｅ，Ｍｉｎｉｓｔｙｒ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｗｕｘｉ　２１４１２２：２．Ｎｉｎｇｂｏ　Ｙｏｕｎｇｏｒ　Ｗｏｏｌ　Ｔｅｘｔｉｌｅ　Ｄｙｅｉｎｇ＆Ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｎｉｎｇｂｏ　３１５１９２；　３．Ｗｕｘｉ　Ｘｉｅｘｉｎ　Ｗｏｌｌｅｎ　ａｎｄ　Ｔｅｘｔｉｌｅ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｗｕｘｉ　２１４１９２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｈｏｐｈｉｌｉａ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｇｒａｄｅ　ｗｏｏｌ　ｋｅｒａｔｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｓｕｌｆｉｄｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｎｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｂｏｎｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｂａｔｈ　ｂｅ￣ｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ　ｏｎ　ＷＯＯｌ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ　ｉＳ　ｔｏ　ｂｒｅａｋ　ｔｈｅ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｂｏｎｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｋｅｒａｔｉｎ　ｓｔｒｕｅ—　ｔｕｒｅ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓｌｉｇｈｔ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｗｏｏｌ　ｆｉｂｅｒｓ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｈａｔ　ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ　ｃｏｕｌｄ　ｂｒｅａｋ　ｃｙｓｔｉｎｅ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｂｏｎｄｓ　ｉ１１　ＷＯＯｌ　ｓｅａｌｅｓ．Ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｉｍａｇｅｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｏｆ　ＷＯＯｌ　ＳＣａｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｋｅｒａ—　ｔｉｎａｓｅ　ａｌｏｎｅ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｏｂｖｉｏｕｓ，ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｔｗｏ—ｂａｔｈ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｃａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｄｅｇｒａｄｅ　ａｎｄ　ｒｅｍｏｖｅ　ｔｈｅｍ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ；ｄｉｓｕｌｉｆｄｅ　ｂｏｎｄｓ；ＷＯＯ１；ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　角蛋白酶是降解角蛋白的一类蛋白酶，由真菌、放　从而使角蛋白丧失不溶于水和抗蛋白酶作用的能力；　线菌或细菌等多种微生物产生　。角蛋白酶来源不　然后进一步水解变性蛋白，生成多肽、寡肽和游离氨基　同，其结构、理化性质、活性也不同，其降解角蛋白的机　酸；最后通过转氨基作用产生氨和硫化物，使角蛋白彻　制也不尽相同。这些酶大多属于细胞外酶，能将羽毛、　底水解　。Ｄａｒｉｏｔ等用孢芽杆菌Ｐ　４５分泌的角蛋白酶　羊毛、头发和指甲等不溶性底物降解　。在食品、饲　降解羽毛，７２　ｈ后降解率达９０％，但它对头发没有显　料、制革、化妆品和医药等领域中有广泛应用　。　著降解作用　。蔡少波等　从腐烂的羊毛织物中分离　角蛋白酶对角蛋白降解机制非常复杂，目前还没　出一种具有降解蛋白能力的细菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，通过优　有定论。普遍认为其降解角蛋白分３个步骤：首先角　化培养条件和处理工艺，该细菌分泌的角蛋白酶能提　蛋白酶破坏角蛋白分子中的二硫键，形成变性角蛋白，　高羊毛和聚酯混合织物的抗毡缩性能和抗拉强度　周　收稿日期：２０１２—０７—０９；修回日期：２０１２—０７—２８　基金项目：国家自然科学基金项目（５１０７３０７３）；教育部长江学者和创新团队发展计划（Ｎｏ．ＩＲＴ１１３５）；江苏省企业研究生工作站研究项目　（苏教研［２０１１］ｌ３号）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（［苏政办发２０１１］１３７号）；江苏省科技支撑计划项目　（ＢＥ２０１２０１９）　－　作者简介：李贲（１９８７一），汉族，男，研究生，研究方向为生物纺织技术，生态染整技术，Ｅ．ｍａｉｌ：ｔ－ｍ０５１５＠１６３．ｃｏｒｎ；　通讯作者：王强（１９７３一），汉族，男，教授，博士，研究方向为生物纺织技术，生态染整技术，Ｅ—ｍａｉｌ：ｑｉａｎｇ—ｗａｎｇ＠１６３．ｃｏｎ。　４７　

第３０卷第１期　２０１３年２月　生物学杂志　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　Ｂ１０Ｌ０ＧＹ　Ｖｏｌ＿３Ｏ　Ｎｏ．１　Ｆｅｂ，２０１３　雯等　刚采用Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌ￣产角蛋白酶与蛋白酶一浴　法处理羊毛，研究结果表明该角蛋白酶能促进蛋白酶　对羊毛鳞片的降解，二者协同作用能有效去除羊毛鳞　片。　本文应用Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ产角蛋白　酶，以羊毛角朊蛋白为底物，通过测定酶反应前后残液　中巯基和肽键的变化，羊毛胱氨酸分析以及ＳＥＭ测　试，对角蛋白酶作用机理做了深入探讨。　Ｉ试验部分　１．１试验材料　凡立丁白坯（３６　ｔｅｘ×３６　ｒｅｘ，１８０　ｇ／ｍ　），无锡协新　毛纺织有限公司；羊毛纤维（美利奴羊毛，平均直径２５　ｔｘｍ，平均长度１０　ａｍ），无锡百芳毛纺厂；Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈ—　ｏｍｏｌＴｚｌ，￥ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ产角蛋白酶（酶活２０　Ｕ／ｍＬ），江南　大学生物工程学院；蛋白酶Ｓａｖｉｎａｓｅ　１６Ｌ（酶活１６００ｏ０　Ｕ／ｍＬ），诺维信公司；其他试剂均为分析纯。　１．２试验仪器　Ｑｕａｎｔａ　２００扫描电子显微镜（荷兰ＦＥＩ公司），　ＵＶ－２８０２Ｓ扫描型紫外／可见分光光度计（美国Ｕｎｉｃｏ　公司），ＷＨＹＦ．２Ｆ恒温振荡水浴锅（台湾瑞比公司），　ＴＤＬ４０Ｂ高速离心机（上海安亭科学仪器厂），Ａｇｉｌｌｅｎｔ　１１００氨基酸自动分析仪（美国Ａｇｉｌｌｅｎｔ公司）。　１．３羊毛角朊蛋白溶液的制备　称取洗净的羊毛纤维１ｇ，剪碎，以１０　ｍＬ含０．７ｇ　十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）、４．８ｇ尿素及０．３５ｇ二硫苏糖　醇（ＤＴＦ）的水溶液于５０％溶解５　ｈ，过滤除去不溶物，　过滤后的溶液以去离子水透析３　ｄ，除去小分子物质即　得角蛋白溶液…　。　１．４试验方法　１．４．１角蛋白酶处理以５　ｍｇ／ｍＬ羊毛角朊蛋白为　底物，用０．０５　ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１缓冲液（ｐＨ值７．５）配制　２．５％（ｖ／ｖ）浓度的角蛋白酶溶液，在５５℃、体积比１：　１０的条件下反应１　ｈ。　以羊毛织物为反应底物，织物先经９０％热水处理　１０　ｍｉｎ，用５０％（Ｏ．Ｗ．ｆ）角蛋白酶溶液（ｐＨ值７．５）、　ＪＦＣ　１　ｇ／Ｌ，在５５℃、浴比１：５０的条件下处理１　ｈ。处　理后试样用清水充分洗净、烘干。　１．４．２　蛋白酶处理　以羊毛角朊蛋白为底物，用　０．０５　ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１缓冲液（ｐＨ值８．５）配制０．１％　（ｖ／ｖ）浓度的蛋白酶溶液，在５５ｃ《二、体积比１：１０的条　件下反应１　ｈ。　以羊毛织物为反应底物，织物先经９０ｑＣ热水处理　１０　ｍｉｎ，用１％（Ｏ．ｗ．ｆ）蛋白酶溶液（ｐＨ值８．５）、ＪＦＣ　１　Ｌ，在５５℃、浴比１：５０的条件下处理１　ｈ。处理后试　样用清水充分洗净、烘干。　１．４．３角蛋白酶、蛋白酶二浴法处理羊毛角朊和羊毛　４８　织物：先经角蛋白酶处理，后经蛋白酶处理，试验方法　同上。　１．５巯基的测定　５，５　。二硫代一２一硝基苯甲酸（ＤＴＮＢ）在ｐＨ值８．０　时与巯基相互作用，生成硫代硝基苯阴离子，硫代硝基　苯阴离子在４１２　ａｍ处的摩尔吸光系数￡为１３６０００，吸　光值与巯基的数量成正比¨引。本实验以羊毛角朊蛋　白为底物，用角蛋白酶断裂其二硫键，然后根据以下反　应测定巯基数。　ｎｎＨ　＋ｗ一　一ｓ　————Ｉ－．Ｒ—Ｓ——Ｓ——Ｒ＋Ｓ　将取２０　ｍｇ　ＤＴＮＢ溶于５　ｍＬ　０．１　ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０　的Ｔｒｉｓ．ＨＣ１缓冲液配制ＤＴＮＢ试剂。取４　ｍＬ　０．１　ｍｏｌ／　Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液（ｐＨ值８．０，含１０　ｍｏｌ／Ｌ尿素和０．０ｌ　ｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ）加入到１　ｍＬ羊毛角朊蛋白中，４０℃保温　３０　ｍｉｎ。然后加入１２５　Ｌ　ＤＴＮＢ试剂，２５ｃ《二下显１０　ｍｉｎ，测定４１２　ｎｍ处溶液吸光度。以半胱氨酸为标准　底物，按下式计算巯基浓度　：　巯基浓度（￣ｍｏｌ／ｇ）＝７３．５３　Ｘ　Ａ４ｌ２×Ｄ／Ｃ　式中：Ｃ为蛋白质浓度（本实验为５．０　ｍｇ／ｍＬ）；Ａ　：为　４１２ｎｍ处吸光度；Ｄ为稀释倍数（本实验为１０）。　浓厦／（ｒａｇ／ｍＬ）　图１　２３８　ｎｍ和２８０／ｌｍ牛血清蛋白标准曲线　Ｆｉｇ　１　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ￥ｅＹｌｌｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　ａｔ　２３８　ｎｍ　ａｎｄ　２８０　ｎｍ　１．６蛋白质标准曲线绘制　利用牛血清蛋白配制一系列标准浓度的蛋白质溶　液，利用紫外分光光度计分别于２３８ｎｍ处和２８０　ｎｍ处　测试各标准浓度蛋白质溶液的吸光度，绘制标准蛋白　的浓度吸光度曲线。　１．７羊毛氨基酸组成分析　将不同条件处理后的羊毛织物在１１０℃、６　ｍｏｌ／Ｌ　

第３０卷第１期　２０１３年２月　生物学杂志　ｊｏｕＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＹ　＿【ｇ　ｒｌ埔　Ｖ０Ｉ＿３０　Ｎｏ．１　Ｆｅｂ．２０１３　ＨＣ１中水解２４　ｈ，水解完毕后，将水解管中液体摇匀过　滤，并用双蒸水将滤液定容至５０　ｍＬ；摇匀后再取１　ｍＬ　∞　∞　柏　∞　０　蛋白质分子中的氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基　的苯环含有共轭双键，导致蛋白质溶液在２８０ｎｍ处有　一滤液于塑料离心管中，冻干机真空浓缩６　ｈ至近干燥　状态。之后取１　ｍＬ　０．０２　ｍｏｌ／Ｌ的盐酸于离心管中震　荡均匀，１４０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１５　ｍｉｎ，吸上清液０．８　ｍＬ于　氨基酸测定仪样品瓶，采用Ａｇｉｌｅｎｔｌ１００氨基酸分析仪　分析羊毛试样水解液的组成及相对质量浓度。　１．８　ＳＥＭ分析　将羊毛纤维在真空条件下表面镀金后，采用Ｑｕａｎ－　ｔａ　２００扫描电子显微镜对其进行观察拍照。测试条　个紫外吸收高峰。此外在２３８ｎｍ处，蛋白质溶液也　有一个肽键特征吸收峰　。利用一定波长下的蛋白　质溶液的紫外吸收值与蛋白质溶液浓度成正比，可对　溶液中蛋白质含量进行定量测试。本文以羊毛角朊蛋　白为底物，分别采用角蛋白酶和蛋白酶对其处理，之后　测试紫外吸收值并通过图１所示牛血清蛋白浓度一吸　光度标准曲线线性拟合方程测试水解液中蛋白质含　量，结果如图３所示。　件：电压５　ｋＶ，放大倍数２０００倍。　２结果与讨论　２．１　角蛋白酶处理后残液中巯基的变化　以５　ｍｇ／ｍＬ羊毛角朊蛋白为底物，分别采用蛋白　酶、角蛋白酶和两者二浴法处理。然后采用ＤＴＮＢ比　法测定残液中巯基数量的变化。　１ｏ０　５　４　—羊毛角朊原样角蛋白酶处理蚩自酶处理　二浴弦　图２不同工艺处理后羊毛角朊蛋白残液中巯基的数量　Ｆｉｇ　２　Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｓｕｌｉｆｄｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｗｏｏｌ　ｋｅｒａｔｉｎ　ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｌｉｑｕｉｄ　ａｆｔｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　从图２中看出，蛋白酶工艺处理后残液中巯基含　量与未经处理羊毛角朊蛋白相比变化不大，分别为　６０．０　Ｉｘｍｏｌ／ｇ和５９．５￣ｍｏｌ／ｇ；角蛋白酶和二浴法工艺　处理后残液巯基含量大幅增加，分别为７４．３　Ｉｘｍｏｌ／ｇ　和７５．０　ｉｚｍｏｌ／ｇ。在羊毛角朊蛋白溶液制备的过程，羊　毛纤维的部分二硫键被ＤＴＴ、ＳＤＳ和尿素共同作用打　断，形成巯基化合物，因此羊毛角朊蛋白中也大量存在　巯基。在单独使用蛋白酶工艺处理后残液巯基数和未　经酶处理的羊毛角朊原样巯基数相差不多，由此推断　蛋白酶对二硫键没有降解作用，不能使之形成巯基化　合物；而Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ产角蛋白酶却有　此功能，所以单用该酶处理后，残液巯基含量较高。二　浴法工艺处理后，巯基数量相对于羊毛角朊原样大幅　增加，但较单独使用角蛋白酶后的巯基数量没有显著　变化，说明二浴法时蛋白酶分解蛋白质过程中巯基数　量没有明显增加。　２．２酶处理羊毛角朊蛋白残液中的蛋白质浓度　一２８Ｏｈｍ　３　　避峰皿简　２　，　Ｏ　角肮＋失枯角揖臼辑　角蚩日　角朊　失捕赁日　盈嗣孵　图３不同紫外吸收波长下的牛血清蛋白标准曲线测得的蛋白质浓度　Ｆｉｇ　３　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ＣＨＩ　Ｖｅ　由图３可知，在２８０ｎｍ波长下，通过测得的紫外吸　光值得到的蛋白质溶液浓度四者都差不多，浓度约为　５　ｍｇ／ｍＬ；在２３８ｎｍ波长下，通过测得的紫外吸收波长　得到的羊毛角朊蛋白＋失活角蛋白酶的蛋白质浓度约　为３．５　ｍｇ／ｍＬ，单独角蛋白酶处理后的羊毛角朊蛋白　的蛋白质浓度约为３．３　ｍ　ｍＬ，与前者相比，只有少量　减少。单独蛋白酶处理后的羊毛角朊蛋白中蛋白质大　量减少，浓度约为２．０　ｍｇ／ｍＬ，和羊毛角蛋白＋失活蛋　白酶相比，减少了４２．９％。本实验所选用蛋白酶Ｓａｖｉ－　ｎａｓｅ　１６Ｌ为丝氨酸蛋白酶，该水解酶是一种肽链内切　酶，主要促使疏水性氨基酸尤其是酪氨酸、氨酸、苯　丙氨酸及亮氨酸的羧基端多肽裂解，作用于它们的肽　键，从而降解蛋白质大分子链，将其水解成小分子蛋白　质或者氨基酸。在２８０ｎｍ波长下，测得的吸光度是由　于溶液中蛋白质分子中的氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸　残基中苯环的共轭双键引起的，经蛋白酶处理后，残液　中含有残基共轭双键的蛋白质总量并没有发生变化，　所以在该波长下测得的蛋白质浓度没有明显变化。在　２３８ｎｍ处测得的吸光度和蛋白质的肽键含量成正比，　蛋白酶处理后的羊毛角朊蛋白的肽键大量减少，从而　导致其在该波长下测得的蛋白质浓度显著降低。角蛋　白酶也属于蛋白酶，它的降解机理和蛋白酶有相似之　４９　　ｇ／宕县＼

第３Ｏ卷第１期　２０１３年２月　生物学杂志　Ｊ０ＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＹ　Ｖ０１．３０　Ｎｏ．１　Ｆｅｂ，２０１３　录组、蛋白质组学和表观遗传学研究发展很快。基因　表达和蛋白功能具有与表型更加紧密地联系，一旦高　［１　１］Ｘｉｏｎｇ　Ｌ，Ａｎｄｒｅｗｓ　Ｄ，Ｒｅｇｎｉｅｒ　Ｆ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｏｆ　ｇｌｙｃｏｐｒｏ—　ｒｅｉｎｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｌｅｃｔｉｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｓｏｔｏｐｅ　ｃｏｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｒｅｓ，　２００３，２（６）：６１８—６２５．　通量的研究手段日趋完善，我们有理由相信优势　的机理将会进一步明确。　参考文献：　［１２］Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｓ，Ｈｏｓａｋａ　Ｋ．ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｄｉｐｌｏｉｄ　ｉｎｂｒｅｄ　ｌｉｎｅｓ　ｏｆ　ｐｏ—　ｔａｔｏｅｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，２０１０，１２０（２）：２０５—２１４．　［１３］鲍文奎．机会与风险—４０年育种研究的思考［Ｊ］．植物杂志，１９９０，　４・３５—３７．　［１］Ｌｉ　Ｌ，Ｌｕ　Ｋ，Ｃｂｅｎ　Ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｄｏｍｉｎａｎｃｅ，ｏｖｅｒｄｏｍｉｎａｎｃｅ　ａｎｄ　ｅｐｉｓｔａｓｉｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｔｈｅ　ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｂｅｔｅｒｏｔｉｅ　ｒｉｃｅ　ｈｙｂｒｉｄｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，　１８Ｏ（３）：１７２５—１７４２　［１４］王得元，殷秋妙，李颖，等．作物优势的分子生物学研究进展　［Ｊ］．西北农业大学学报，１９９９，２７（１）：４５—４７　［１５］Ｎｉ　Ｚ，Ｋｉｍ　Ｅ　Ｄ，Ｈａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ａｌｔｅｒｅｄ　ｃｉｒｃａｄｉａｎ　ｒｈｙｔｈｍｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　［２］Ｍｉｔｃｈｅｌｌ—Ｏｌｄｓ　Ｔ．Ｉｎｔｅｒｖａｌ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｌｏｃｉ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｈｅｔｅｒｏ－　ｓｉｓ　Ａｒａｂｉｄｏｐｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１９９５，１４０（３）：１１０５—１１０９．　［３］Ｌａｒｉｅｐｅ　Ａ，Ｍａｎｇｉｎ　Ｂ，Ｊａｓｓｏｎ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ：　ｍｕｌｔｉｐａｒｅｎｔａｌ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｔｒａｉｔ　ｌｏｃｉ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｃｏｎｔｒａｓｔｅｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｖｉｇｏｕｒｉｎ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ａｎｄ　ａｌｌｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４５７（７２２７）：３２７　３３１　［１６］Ｍｕｎａｒｏ　Ｅ　Ｍ，Ｅｙｈｅｒａｂｉｄｅ　Ｇ　Ｈ，ＤＡｎｄｒｅａ　Ｋ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ　ｘ　ｅｎｖｉ—　ｒｏｎｍｅｎｔ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ：ｗｈａｔ　ｄｒｉｖｅｓ　ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ　ｆｏｒ　ｇｒａｉｎ　ｙｉｅｌｄ？［Ｊ］．　Ｆｉｅｌｄ　Ｃｒｏｐｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，１２４（３）：４４１—４４９．　ａｐｐａｒｅｎｔ　ｏｖｅｒｄｏｍｉｎａｎｃｅ　ａｍｏｎｇ　ｔｒａｉｔｓ　ｏｆ　ａｇｒｏｎｏｍｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ＿）［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１２，１９０：７９５—８１１．　［４］Ｐｏｗｅｒｓ　Ｌ．Ａｎ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｊｏｎｅ　ｔｈｅｏｒｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ　［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｎａｔｕｒａｌｉｓｔ，１９９４，７（３）：８—２７．　［】７］Ｆｕ　ｚ　Ｙ，Ｊｉｎ　ｘ　Ｎ，Ｄｉｎｇ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｂｅｔｅｒｏｓｉｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍａｉｚｅ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１１，１ｌ（８）：１４６２—１４７２　［１８］Ｆｕｊｉｍｏｔｏ　Ｒ，Ｔａｙｌｏｒ　ＪＭ，Ｓｈｉｒａｓａｗａ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ　ｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｈｙ—　ｂｒｉｄｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｃ２４　ａｎｄ　Ｃｏｌ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　［５］Ｙｕ　Ｓ／３，Ｌｉ　Ｊ　ｘ，Ｘａ　Ｃ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆｅｐｉｓｔａｓｉｓ　ａｓ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｂａ—　ｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ　ｉｎ　ａｎ　ｅｌｉｔｅ　ｒｉｃｅ　ｈｙｂｒｉｄ『Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　１９９７，９４（１０）：９２２６～９２３１．　ｃａｐａｃｉｔｙ［Ｃ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕ・　ｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，２０１２，１０９（１８）：７１０９—７１　１４　［６］Ｍａｃｉａ　Ｊ，Ｓｏｌｅ　Ｒ　Ｖ，Ｅｌｅｎａ　Ｓ　Ｆ．Ｔｈｅ　ｃａｕｓｅｓ　ｏｆ　ｅｐｉｓｔａｓｉｓ　ｉｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｎｅｔｗｏｒｋｓ　Ｊ１．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０１２，６６：５８６—５９６．　［１９］Ｇｉｒｋｅ　Ａ，Ｓｃｈｉｅｒｈｏｌｔ　Ａ，Ｂｅｅｋｅｒ　Ｈ　Ｃ．Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒａｐｅｓｅｅｄ　ｇｅｎｅ　ｐｏｏｌ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎ￣ｚｐｕｓ　ＩＩ：Ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，　２Ｏｌ２，１２４（６）：１Ｏ１７—１０２６．　［７］Ｂｉｒｋｙ　Ｃ　Ｗ　Ｊｒ．Ｒｅｌａｘｅｄ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ａｎｄ　ｏｒｇａｎｅｌｌｅ　ｈｅｒｅｄｉｔｙ［Ｊ］．ｓｃｉ－　ｅｎｃｅ，１９７８，２２２（４６２３）：４６８—４７５　［８］Ｔｉｌｎｅｙ　Ｎ　Ｌ，Ｂａｎｃｅｗｉｃｚ　Ｊ，Ｒｏｗｉｎｓｋｉ　Ｗ，ｅｔ　ａ１　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃａｒｄｉａｃ　ａｌ—　ｌｏｇｒａｆｔｓ　ｉｎ　ｒａｔｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｈｏｓｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｏ—　［２Ｏ］Ｇｏｆｆ　Ｓ　Ａ．Ａ　ｕｎｉｆｙｉｎｇ　ｔｈｅｏｒｙ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｍｕｈｉｇｅｎｉｃ　ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ：ｅｎｅｒｇｙ　ｅｆｆｉ—　ｃｉｅｎｃｙ，ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｒｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．　Ｎｅｗ　Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，２０１１，１８９：９２３—９３７．　ｃｏｌｓ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９７８，２５（１）：１—６．　［９］Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ　Ｄ，Ｖｙａｓ　Ｍ　Ｃ，Ｃｈａｕｄｈａｒｙ　Ｒ　Ｋ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｅｏ—　ｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｃｏｕｎｔ　ｄｕｒｉｎｇ　ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｉｎｄｉａｎ　ＪＭｅｄ　Ｒｅｓ，１９８３，７８　Ｓｕｐ—　ｐｌ：１６２—１６３．　［２１］Ｚｈｕ　Ｘ，Ａｉｎｉｊｉａｎｇ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｅｔｅｒｏｓｉｓ　ｉｎ　ｃｏｔｔｏｎ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎ—　ｄａｔｉｏｎ　ｐａｒｅｎｔ　ＣＲＩ一１２　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｅｄｉｇｒｅｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｌｉｎｅｓ［Ｊ］Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，　２０１１，１８０（２）：２２１～２２７．　ｆ　１０］Ｔｓａｆｔａｒｉｓ　Ａ　Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　ｉｎｂｒｅｄｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｈｅｔｅｒｏｔｉｃ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｇ　Ｃｌｉｎ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｓ，１９９０，３４４（１２）：６３９—６６４．　（上接５０页）　［４］Ｐａｒｋ　Ｇ　Ｔ，Ｓｏｎ　Ｈ　Ｊ．Ｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｎｅｇａｔｅｒｉｕｍ　Ｆ　７—　１，ａ　ｆｅａｔｈｅｒ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ－　ｓｅａｒｃｈ，２００７，２：１—８．　的促进作用［Ｊ］．纺织学报，２０１１，３２（１）：８２—８８．　［１１］Ｙａｍａｕｅｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｕｃｈｉ　Ａ，Ｋｕｓａｎｏｋｉ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔａ—　ｂｌｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｋｅｒａｔｉｎｓ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｄｅｇｒａ—　ｄａｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｆｉｌｍｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｒｅ—　ｓｅａｒｃｈ，１９９６，３１：４３９—４４４．　［５］Ｖａｒｂａｎｅｔｓ　Ｌ　Ｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙ—　ｎｅｔｓ［Ｊ］．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｈｉｃｈｎｙ　Ｚｈｕｒｎａｌ，２００３，６５（１）：１８２—１９０．　［６］曾　毅，李忠琴，许小平．角蛋白酶的研究进展［Ｊ］．海峡药学，　２００４，１６（６）：１０～１３．　［１２］罗明江，罗春霞，吴赣香．Ｅｌｌｍａｎ　ｓ试剂比法测定食品中蛋白　质的巯基和二硫键［Ｊ］．郑州粮食学院学报，１９８６，２３（１）：９２　９５．　［７］杨建强，汤国营．角蛋白酶研究进展［Ｊ］．生物技术通报，２００５，　１６（２）：２０１—２０３．　［１　３］Ｍｉｎｅ　Ｙ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐＨ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｒｙ　ｈｅａｔｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｅｌｌｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒ—　ｔｉｅｓ　ｏｇ　ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９６，　２９（２）：１５５—１６１．　［８］Ｄａｒｏｉｔ　Ｄ　Ｊ，Ｃｏｒｅａ　Ａ　Ｐ　Ｆ，Ｂｒａｎｄｅｌｌｉ　Ａ．Ｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ｐ４５　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ａｍａｚｏｎ　ｂａｓｉｎ　ｆｉｓｈ　Ｐｉａｒａｃｔｕｓ　［１４］曹红翠．紫外分光光度法测定蛋白质的含量［Ｊ］．广东化工，　２００７，８（３４）：９３—９５．　ｍｅｓｏｐｏｔａｍｉｅｕｓ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ＆Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，　２００９，６３（３）：３５８—３６３．　［１５］涂国全，张宝，叶亚建，等．链霉菌分解角蛋白的生化机制研　［９］Ｃａｉ　Ｓ　Ｂ，Ｈｕａｎｇ　ｚ　Ｈ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ　Ｑ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｋｅｒａ—　ｔｉｎａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉｃａｌ　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　ｅｎｅｙｍａｔｉｃ　ｓｔｕｄｙ　ｆｏｒ　ｉｔｓ　ｉｍｐｒｏｖｅ－　ｍｅｎｔ　ｏｎ　ｓｈｒｉｎｋ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｅｎｓｉｌｅ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｗｏｏｌ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ－　究Ⅲ含硫化合物对角蛋白酶作用机理和角蛋白降解的生化机　制初步研究［Ｊ］．江西农业大学学报，１９９８，２０（１）：６—１０．　［Ｉ６］Ｗａｌａｗｓｋａａ　Ａ，Ｒｙｂｉｃｋｉ　Ｅ，Ｆｉｌｉｐｏｗｓｋａ　Ｂ．Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｂｌｅｎｄｅｄ　ｆａｂｒｉｃ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，　１６３：１１２—１２６．　ｏｎ　ｗｏｏｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｆｔｅｒ　ａｎ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｒｏｇｒ　Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｐｏｌｙｍ　Ｓｃｉ，２００６，１３２：１３１—１３７．　［１０］周　雯，纪惠军，王　强，等．角蛋白酶对羊毛蛋白酶防毡整理　７０